LCWE誘導小鼠冠狀動脈炎的實驗研究——川崎病動物模型的建立.pdf

1、背景 川崎病(Kawasakidisease，KD)是一種常見的兒童自身免疫性血管炎綜合征，并發(fā)冠狀動脈瘤(CAA)和冠脈狹窄是青壯年猝死和心肌梗塞發(fā)生的重要原因，新近研究表明，兒童川崎病是成人缺血性心臟病發(fā)生的新的危險因素。川崎病已取代風濕熱成為兒童后天性心臟病的主要病因。雖然靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)和阿斯匹林聯(lián)合治療方案廣泛應用后，川崎病死亡率和冠狀動脈并發(fā)癥明顯下降，但近年發(fā)現(xiàn)IVIG治療耐藥病例增多。迄今病因及發(fā)病

2、機制未明，目前認為川崎病符合感染性疾病和自身免疫性疾病兩大特征，細菌超抗原致病是引起川崎病的重要原因，川崎病異常的免疫激活，是由細菌或病毒毒素以超抗原機制介導引起的。但臨床川崎病研究取材困難，國內外目前尚缺少公認的川崎病動物模型用于血管炎性損傷和冠狀動脈瘤形成的發(fā)生機制研究。本研究采用干酪乳桿菌細胞壁成分(Lactobacilluscaseicellwallextract，LCWE)注入幼年小鼠腹腔，觀察能否引致小鼠冠狀動脈炎，旨在探討

3、建立新的川崎病動物模型的可能性；探討LCWE的超抗原活性及其與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動脈炎發(fā)生的關系及作用機制。并對臨床病例進行研究以客觀評價IVIG治療和預防川崎病冠狀動脈病變的療效，探討IVIG療效的影響因素。 第一部分一、LCWE誘導小鼠川崎病冠狀動脈炎動物模型的建立 目的：探討干酪乳桿菌細胞壁成分誘導產(chǎn)生川崎病冠狀動脈炎動物模型的可能性。 方法：制備LCWE(1mg/ml)。將100只BALB/C小鼠隨

4、機分為實驗組和對照組各50只。分別腹腔注射0.5mlLCWE和PBS。注射后1d、3d、5d、10d、和28d每組取10只小鼠分批采血、處死、留取心臟病理標本。在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察各器官組織病理變化；應用FACSort流式細胞儀檢測小鼠CD4+、CD8+T細胞亞群的百分比，計算外周血CD4+、CD8+T細胞亞群的絕對數(shù)量；采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測LCWE注射后3d小鼠血漿進行TNF-α、IL-1β和IL-

5、6水平；并測量體重、心臟、脾臟重量、脾臟/體重及心臟/體重比值。 結論：LCWE單次腹腔注射能夠誘導BALB/C小鼠產(chǎn)生冠狀動脈炎及心肌炎病理改變，是一種能夠可靠反映川崎病冠狀動脈炎的良好動物模型。其群體發(fā)病率高，病理損害與LCWE誘導的免疫反應有關。 二、LCWE的超抗原活性及誘導小鼠冠狀動脈炎發(fā)生的超抗原機制 目的：研究超抗原LCWE激活小鼠T淋巴細胞TCRVβ的特異性，LCWE刺激表達TCRVβ2、4、6+

6、T細胞增殖的特征；研究LCWE激活小鼠T細胞CD69體內外表達的動力學及其作用；探討LCWE的超抗原活性與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動脈炎發(fā)生的關系及作用機制。 方法：①4～6周齡幼年BALB/C小鼠122只，隨機分為實驗組與對照組。按前述方法應用LCWE建立小鼠冠狀動脈炎動物模型。 ②小鼠分別腹腔注射超抗原LCWE、多克隆刺激劑ConA和PBS，應用流式細胞儀觀察超抗原刺激TCRVβ2、4、6+T細胞增殖的動力學變化。檢

7、測CD4+CD69+T細胞表達的百分率及動力學變化。 ③LCWE或ConA體外刺激BALB/C小鼠脾單個核細胞，觀察離體條件下LCWE與小鼠TCRVβ結合的特異性；觀察LCWE5、10、15、20、25、40μg/ml或SEB2.5μg/ml或ConA溶液(1mg/ml，20μl)終濃度10μg/ml或PBS刺激下；CD4+T細胞CD69表達的陽性率及動力學變化。 ④采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測血漿IL

8、-1β、IL-6和TNF-α水平。 ⑤應用相關模型觀察TCRVβ6+CD4+T細胞增殖與T細胞活化CD69抗原表達和與血漿TNF-α水平變化的相關關系，TCRVβ6+CD4+T細胞增殖與血漿TNF-α水平變化的相關關系。 ⑥應用Logistic回歸模型，分析冠狀動脈炎發(fā)生與TCRVβ+T細胞增殖、與T淋巴細胞活化及與TNF-α產(chǎn)生的關系。 結論：①LCWE誘導小鼠產(chǎn)生嚴重的免疫性損傷和冠狀動脈炎的作用是通過超抗原

9、機制實現(xiàn)的；②LCWE可直接誘導早期T細胞活化，具體表現(xiàn)為CD4+CD69+T細胞顯著增高；③LCWE誘導機體產(chǎn)生炎性細胞因子TNF-α顯著增多，該炎性因子可能是引起冠狀動脈炎產(chǎn)生的重要機制。阻斷TNF-α的活性有可能成為川崎病治療的藥物靶點。 三、白三烯B4受體在免疫性血管炎發(fā)病機制中的作用 目的：研究冠狀動脈炎模型小鼠心臟和肝臟中BLT1mRNA和BLT2mRNA的表達；模型小鼠脾臟中CD4+T細胞BLT2的表達，探

10、討LTB-BLT1、LTB-BLT2通路在小鼠冠狀動脈炎發(fā)生中的作用。 方法：采用逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT—PCR)的方法，提取細胞總RNA，以Olig(dT)引導合成cDNA第一鏈，經(jīng)PCR擴增，以BLT1或BLT2為引物，從心臟和肝臟組織中擴增出BLT1mRNA或BLT2mRNA。采用凝膠圖像分析儀分析BLT1與β-actinmRNA及BLT2與β-actinmRNA的表達水平；應用流式細胞術間接熒光標記檢測脾單個核細胞中

11、CD4+T細胞上BLT2的表達。采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平。 結果：擴增出分子量為430bp的BLT1mRNA和分子量為331bpBLT2mRNA。模型小鼠在注射LCWE后6h開始升高，12h達高峰，持續(xù)至3d逐漸降低，5d時回到基線；心臟和肝臟表達BLT1mRNA和BLT2mRNA，分別進行組內各時間點比較，注射LCWE后12小時，BLT1mRNA和BLT2mRNA的

12、光密度比值顯著升高，P＜0.05。流式細胞術檢測顯示，在注射LCWE后1d小鼠脾臟BLT2+CD4+T細胞表達高峰，高峰時間較BLT2mRNA在心臟和肝臟的表達延遲。模型小鼠注射LCWE后3d血漿TNF-α、IL-1及IL-6水平較對照組比較明顯增高，P＜0.001。 結論：在LCWE誘導的小鼠免疫性損傷和冠狀動脈炎的產(chǎn)生過程中，BLT1、BLT2在肝臟和心臟高表達；在脾單個核細胞BLT2在CD4+T細胞表達增加。LCWE能誘導

13、小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6等多種炎性介質分泌增加。因此，LTB-BLT1、LTB-BLT2通路可能在小鼠冠狀動脈炎發(fā)生中起重要作用。 第二部分靜脈輸注丙種球蛋白防治川崎病冠狀動脈病變的療效評價 目的：客觀評價靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)治療和預防川崎病(KD)冠狀動脈病變(CAL)的療效，探討IVIG療效的影響因素。 方法：對314例KD患兒進行回顧性對比觀察。按照治療分為阿斯匹林(ASA)+IVIG

14、組和ASA組，觀察兩組CAL發(fā)生、恢復情況、不同時機不同劑量IVIG治療KD療效，及平均住院時間、退熱時間、總熱程、血小板計數(shù)、血沉、C反應蛋白等臨床及實驗室指標，急性期出現(xiàn)CAL者分別于病程1m，3m，6m，12m復查。 結果：ASA+IVIG組CAL發(fā)生率34.3％，ASA組56.0％，兩組比較P＜0.001。應用IVIG2.0g/kg或1.0g/kg以及在病程3～10天應用IVIG，CAL發(fā)生率低，P＜0.05。22.2％