色素上皮衍生因子啟動子區(qū)基因多態(tài)性與糖尿病微血管病變.pdf

1、目的：糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）及糖尿病腎臟病變（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的微血管病變，是糖尿病患者致盲及腎衰的重要原因。色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor，PEDF）分子量為50kb，含418個氨基酸，是一種多功能的絲氨酸蛋白酶抑制劑。近年來研究顯示，在糖尿病微血管并發(fā)癥大鼠模型眼部及腎臟局部組織中，其表達(dá)量有

2、所下降，而在糖尿病微血管并發(fā)癥患者血清水平則有所升高。在視網(wǎng)膜，晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glucose ends，AGEs）誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活，而PEDF通過抑制AGEs阻止視網(wǎng)膜炎癥的發(fā)生。在腎臟組織，PEDF可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子β-1（transforming growth factorβ-1，TGFβ-1）和結(jié)締組織生長因子（Connective

3、Tissue Growth Factor，CTGF）的表達(dá)，顯著降低細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生。PEDF通過抑制炎癥以及氧化應(yīng)激反應(yīng)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制纖維化作用起到延緩糖尿病微血管病變發(fā)生、發(fā)展的作用。單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）是在基因組水平上由單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。PEDF編碼基因

4、位于染色體17p13.1，基因長約16kb，其啟動子區(qū)SNP位點可能通過影響基因轉(zhuǎn)錄活性而改變蛋白的表達(dá)。本研究分析271例河北地區(qū)漢族人PEDF啟動子區(qū)2個SNP位點與2型糖尿病微血管病變的關(guān)系，探討PEDF在糖尿病微血管病變發(fā)生、發(fā)展中的作用及作用機制。
　　 方法：選取我院271例住院的2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）患者，均為河北地區(qū)漢族人，根據(jù)有無糖尿病微血管并發(fā)癥分成兩組：無糖尿

5、病微血管病變組（對照組）105例，合并糖尿病微血管并發(fā)癥組（病變組）166例。依據(jù)病史、臨床癥狀及相關(guān)化驗檢查排除大血管病變。所有研究對象均測量身高及體重，計算體重指數(shù)（body mass index，BMI）。同時測定空腹甘油三酯（triglyeride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白膽

6、固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C），空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）以及糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）等生化指標(biāo)。采用放射免疫分析法測定空腹血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，并應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模式評估法（homeostasis model asse

7、ssment，HOMA）計算胰島素抵抗指數(shù)。同時隨機抽取對照組患者30例，病變組患者33例，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血清PEDF水平。采用微量快速DNA提取法提取外周血白細(xì)胞DNA，聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法檢測PEDF基因啟動子區(qū)rs12150053及rs12948385的基因型和等位基因頻率分布情況。數(shù)

8、據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS13.0版軟件包進(jìn)行，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組計量資料行t檢驗，計數(shù)資料用X2檢驗。以Logistic回歸法計算相對風(fēng)險度的比值比（odds ratio，OR）及95％可信區(qū)間（confidence Interval，CI）。采用2LD軟件分析rs12150053 T/C與rs12948385 G/A基因連鎖不平衡，EH軟件分析基因單體型頻率。
　　 結(jié)果：
　　 1、兩組性別構(gòu)成比無顯著

9、性差異，與對照組相比，病變組的年齡及病程顯著增高（P<0.01），TG、LDL-C、BMI及HbA1c亦高于對照組。病變組與對照組比較FBG、TC、HDL-C、HOMA-IR均無顯著性差異。
　　 2、病變組血清PEDF水平為：269.2±138.6 pg/ml，對照組血清PEDF水平為：199.6±85.4 pg/ml，兩組比較具有顯著性差異（P=0.02）。
　　 3、對照組rs12150053 C/T和rs1215

10、0053 G/A多態(tài)位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。PEDF啟動子區(qū)rs12150053-790C/T多態(tài)T/T、C/T、C/C基因型頻率在對照組和病變組分別為79.0％、20.0％、1.0％和67.5％、30.7％、1.8％，兩組相比無顯著性差異（P=0.099）。C、T等位基因頻率在對照組和病變組分別為87.1％、12.9％和82.8％、17.2％，兩組相比具有顯著性差異（X2=3.951

11、，P=0.047）。與T/T基因型相比，C/T+C/C基因型增加糖尿病微血管病變的發(fā)病風(fēng)險，OR值為1.82（95％CI=1.027～3.221）。
　　 4、PEDF啟動子區(qū)rs12948385-358G/A多態(tài)G/G、G/A、A/A基因型頻率在對照組和病變組分別為75.2％、21.9％、2.9％和59.0％、36.7％、4.3％，兩組相比具有顯著性差異（P=0.024）。G、A等位基因頻率在對照組和病變組分別為86.2％、1

12、3.8％和77.4％、22.6％，兩組相比具有顯著性差異（P=0.025）。與G/G基因型相比，G/A+A/A基因型增加糖尿病微血管病變的發(fā)病風(fēng)險，OR值為2.108（95％CI=1.228～3.619）。
　　 5、rs12150053T/C和rs12948385 G/A SNP間存在連鎖不平衡關(guān)系（D'=0.68）。應(yīng)用EH軟件對2個SNPs位點分析發(fā)現(xiàn)，T/G單體型在對照組最常見，占77.4％。包含rs12150053 T

13、與rs12948385 A的單倍體型在病變組顯著性增高，可能會增加糖尿病微血管病患病風(fēng)險，OR值為1.767（95％CI=1.061～2.944）。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用碘化鉀快速DNA提取法提取外周血DNA簡便、快速、經(jīng)濟(jì)，所得DNA純度及濃度較高，可應(yīng)用于DNA基因組研究。
　　 2、糖尿病微血管病變可能與病程相關(guān)，糖化血紅蛋白、體重指數(shù)、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇可能是糖尿病微血管病變的危險因素。