VEGFR-1陽性造血祖細(xì)胞在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、背景和目的： 乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。乳腺癌轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預(yù)后差的主要原因，有效的切斷轉(zhuǎn)移途徑，成為臨床除手術(shù)切除乳腺原發(fā)腫瘤外，提高患者生存率，延長患者生存時間，徹底根治乳腺癌的關(guān)鍵問題。 本研究以乳腺癌為研究對象探討造血祖細(xì)胞對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響作用，主要分兩部分進(jìn)行，首先分離人臍帶血造血祖細(xì)胞，觀察體外培養(yǎng)條件下其對于乳腺癌細(xì)胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響，并應(yīng)用整體

2、可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型研究裸鼠體內(nèi)VEGFR-1+HPC對乳腺癌轉(zhuǎn)移能力的影響，為探討乳腺癌轉(zhuǎn)移形成機(jī)制，尋求新的抗乳腺癌靶標(biāo)、阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究內(nèi)容： 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為進(jìn)一步研究VEGFR-1+HPC在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，提供良好的動物模型。 通過免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)分選出人臍帶血CD133+HPC，與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測其對乳腺癌細(xì)胞增殖、黏附以及侵襲

3、能力的影響。 通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測乳腺癌原位接種后不同時間裸鼠肝組織內(nèi)。VEGFR-1+HPC含量的變化，驗(yàn)證VEGFR-1+HPC在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。 通過免疫組織化學(xué)技術(shù)、Westernblot技術(shù)檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9等在裸鼠荷瘤不同時期含量的變化，初步探討VEGFR-1+HPC促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。 方法和結(jié)果： 1.整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型的建立

4、 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞，挑選陽性克隆后篩選出穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株pEGFP-MDA-MB-231細(xì)胞；通過體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，建立高肝轉(zhuǎn)移的乳腺癌動物模型，利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)EGFP的特點(diǎn)，借助整體熒光體視鏡結(jié)合IPP5.0軟件采集、分析EGFP發(fā)出的熒光信號，在動物活體實(shí)時觀察乳腺癌局部成瘤及轉(zhuǎn)移情況；應(yīng)用常規(guī)病理學(xué)

5、方法對乳腺癌原位及轉(zhuǎn)移動物模型進(jìn)行評價和鑒定。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的pEGFP-MDA-MB-231細(xì)胞穩(wěn)定、高效的表達(dá)EGFP，且增殖能力與MDA-MB-231相比，差異沒有顯著性；pEGFP-MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠乳房墊原位接種的成功率高達(dá)60％，組織塊原位接種的成功率高達(dá)100％；第一代裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移率較低，待腫瘤長至適合大小時，取瘤組織采用外科手術(shù)原位接種的方法將瘤組織塊縫合在裸鼠乳房墊下，經(jīng)體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，裸鼠體內(nèi)傳

6、代3次后，腫瘤肝轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)，至接種第6周后，幾乎所有的裸鼠均出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。通過常規(guī)病理學(xué)的方法，驗(yàn)證了可視化高肝轉(zhuǎn)移動物模型的可靠性。 2.通過免疫磁珠分選技術(shù)分選出人臍帶血CD133+HPC，體外觀察其對乳腺癌細(xì)胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響 取健康、新鮮的臍帶血，利用人CD133免疫磁珠，采用免疫磁珠分選技術(shù)，分選出CD133+HPC，用含20％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)1-2周，與人乳腺癌MDA-MB

7、-231細(xì)胞共同培養(yǎng)24h后，采用MTT、Transwell的方法檢測CD133+HPC在體外培養(yǎng)條件下對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響。 結(jié)果：免疫磁珠分選技術(shù)分選的CD133+HPC陽性率高達(dá)80％以上，分選出的CD133+HPC體外培養(yǎng)1～2周，減少誘導(dǎo)分化，仍保留祖細(xì)胞的特征。取培養(yǎng)1-2周的CD133HPC與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，MTT法檢測CD133+HPC對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，

8、與腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，差異具有顯著性。CD133+HPC與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h，胰酶消化后接種于鋪有FN的96孔板，進(jìn)行細(xì)胞基質(zhì)黏附試驗(yàn)。MTT法檢測CD133+HPC對乳腺癌細(xì)胞黏附能力的影響，與腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞黏附能力顯著增強(qiáng)，差異具有顯著性。采用Transwell小室觀察CD133+HPC對腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的影響，與腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組腫瘤細(xì)胞穿過基底

9、膜的能力顯著增強(qiáng)，差異具有顯著性。 3.流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察裸鼠腫瘤接種后不同時間VEGFR-1+HPC量的變化 在裸鼠乳腺癌原位接種前、接種后的不同時期頸椎脫臼法處死裸鼠，取裸鼠的肝組織，制成單細(xì)胞懸液后行流式細(xì)胞術(shù)檢查不同荷瘤時間裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC細(xì)胞含量的變化；送檢FCM后，剩余的裸鼠肝、肺組織常規(guī)石蠟包埋做成蠟塊，切成3μm厚的薄片，免疫組織化學(xué)染色行VEGFR-1、CD133陽性細(xì)胞

10、的檢測與分析，觀察VEGFR-1、CD133在裸鼠肝組織內(nèi)的定位和細(xì)胞簇形成情況，進(jìn)一步驗(yàn)證FCM檢驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果：VEGFR-1+HPC的數(shù)量隨裸鼠乳腺癌原位接種的不阿時間而改變，乳腺癌接種后第2周、第4周、第6周裸鼠肝組織懸液中VEGFR-1+HPC的含量較接種前裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC的含量明顯增加，差異有顯著性；腫瘤接種后，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC在腫瘤細(xì)胞到達(dá)肝組織前即可被檢

11、測到其含量逐漸增加，各組之間的差異具有顯著性，與時間呈正相關(guān)。說明VEGFR-1+HPC提前腫瘤細(xì)胞到達(dá)預(yù)轉(zhuǎn)移部位，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，VEGFR-1+HPC的量逐漸增加，VEGFR-1+HPC提前到達(dá)預(yù)轉(zhuǎn)移部位，可能吸引腫瘤細(xì)胞的遷移；其含量隨著荷瘤時間的延長而增加，可能為腫瘤細(xì)胞的定居提供適宜的微環(huán)境。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：VEGFR-1、CD133陽性細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞到達(dá)肝組織前即有表達(dá)，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，陽性細(xì)胞數(shù)增

12、加且聚集成小的細(xì)胞簇，主要分布在裸鼠肝組織的被膜下、匯管區(qū)小血管旁等部位，與腫瘤轉(zhuǎn)移時腫瘤細(xì)胞最早到達(dá)形成轉(zhuǎn)移瘤的部位基本一致。 4.Westernblot檢測裸鼠腫瘤接種后不同時間肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9的表達(dá)，初步探討VEGFR-1+HPC促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制 裸鼠組織標(biāo)本送檢FCM后，剩余的裸鼠取100-200mg肝組織抽提組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并分裝，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行Westernbl

13、ot檢測裸鼠腫瘤接種后不同時期肝組織內(nèi)MMP-2、MMP-9表達(dá)量的改變。 結(jié)果：在裸鼠腫瘤接種前以及接種后的不同時間，尚未形成轉(zhuǎn)移前組織內(nèi)的MMP-2、MMP-9等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子隨著腫瘤接種和裸鼠荷瘤時間的延長而表達(dá)量增加。初步表明MMP-2、MMP-9可能在VEGFR-1+HPC促腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，在腫瘤細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移灶前可能引起了局部微環(huán)境中的細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的改變，降解了細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的到達(dá)和定居形成一個適宜的微環(huán)

14、境。 5.VEGFR-1、CD133陽性細(xì)胞在人乳腺癌組織標(biāo)本中免疫組織化學(xué)方法檢測與分析，進(jìn)一步驗(yàn)證VEGFR-1+HPC在人乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。 收集南方醫(yī)院普外科2007年4月至2008年4月手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本10例，10例區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌取白手術(shù)切除標(biāo)本所附淋巴結(jié)，女性，患者年齡31～85歲。5例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生標(biāo)本取自南方醫(yī)院普外科2007年8月至2008年5月。全部標(biāo)本術(shù)前均未接受化療及放療，所有組織均用10

15、％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3μm厚切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果：在乳腺癌患者的區(qū)域淋巴結(jié)可以檢測到CD133、VEGFR-1陽性細(xì)胞。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的區(qū)域淋巴結(jié)中CD133、VEGFR-1陽性細(xì)胞簇的量較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的區(qū)域淋巴結(jié)中CD133、VEGFR-1陽性細(xì)胞簇的量多，所形成的細(xì)胞簇包含的細(xì)胞數(shù)目較多。表明CD133、VEGFR-1陽性細(xì)胞可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能可以做為預(yù)測乳腺癌

16、轉(zhuǎn)移的一個指標(biāo)。 結(jié)論： 1.成功地穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP至人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，并采用體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，建立了整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移及臨床前的治療提供了一種良好的動物模型。 2.通過免疫磁珠分選技術(shù)可以得到純度較高的CD133+HPC，該細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，短期內(nèi)不會誘導(dǎo)分化，可以保留其祖細(xì)胞特性。CD133+HPC與乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)可以顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖、黏附

17、以及侵襲能力。 3.VEGFR-1+HPC在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。VEGFR-1+HPC在乳腺癌細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移灶前，提前到達(dá)預(yù)轉(zhuǎn)移部位，其含量隨著裸鼠荷瘤時間的延長而不斷增加，而且其在預(yù)轉(zhuǎn)移組織的表達(dá)部位與腫瘤轉(zhuǎn)移最先到達(dá)的部位基本一致?？赡芪橄侔┘?xì)胞的遷移，并為轉(zhuǎn)移瘤的形成提供適合定居的轉(zhuǎn)移微環(huán)境。 4.VEGFR-1+HPC促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用可能與轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9等的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。VE

18、GFR-1+HPC可能通過改變局部微環(huán)境中MMP-2、MMP-9等轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)為轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的定居與轉(zhuǎn)移瘤的形成提供適宜的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。 創(chuàng)新： 1.建立了整體可視化乳腺癌原位接種高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究提供了較理想的實(shí)驗(yàn)工具. 2.成功篩選了CD133+HPC，發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌細(xì)胞具有促增殖、黏附及侵襲的作用3.在人癌實(shí)驗(yàn)層次上證實(shí)了VEGFR-1+HPC對乳腺癌轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究提