VEGFR-1陽性造血祖細胞在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、背景和目的： 乳腺癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。乳腺癌轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者預后差的主要原因，有效的切斷轉(zhuǎn)移途徑，成為臨床除手術切除乳腺原發(fā)腫瘤外，提高患者生存率，延長患者生存時間，徹底根治乳腺癌的關鍵問題。 本研究以乳腺癌為研究對象探討造血祖細胞對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響作用，主要分兩部分進行，首先分離人臍帶血造血祖細胞，觀察體外培養(yǎng)條件下其對于乳腺癌細胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響，并應用整體

2、可視化乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型研究裸鼠體內(nèi)VEGFR-1+HPC對乳腺癌轉(zhuǎn)移能力的影響，為探討乳腺癌轉(zhuǎn)移形成機制，尋求新的抗乳腺癌靶標、阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移提供實驗依據(jù)。 研究內(nèi)容： 通過細胞轉(zhuǎn)染技術建立整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為進一步研究VEGFR-1+HPC在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用，提供良好的動物模型。 通過免疫磁珠細胞分選技術分選出人臍帶血CD133+HPC，與乳腺癌細胞共培養(yǎng)，檢測其對乳腺癌細胞增殖、黏附以及侵襲

3、能力的影響。 通過流式細胞術、免疫組織化學技術檢測乳腺癌原位接種后不同時間裸鼠肝組織內(nèi)。VEGFR-1+HPC含量的變化，驗證VEGFR-1+HPC在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。 通過免疫組織化學技術、Westernblot技術檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關因子MMP-2、MMP-9等在裸鼠荷瘤不同時期含量的變化，初步探討VEGFR-1+HPC促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機制。 方法和結(jié)果： 1.整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型的建立

4、 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導入乳腺癌高轉(zhuǎn)移細胞株MDA-MB-231細胞，挑選陽性克隆后篩選出穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的細胞株pEGFP-MDA-MB-231細胞；通過體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，建立高肝轉(zhuǎn)移的乳腺癌動物模型，利用腫瘤細胞表達EGFP的特點，借助整體熒光體視鏡結(jié)合IPP5.0軟件采集、分析EGFP發(fā)出的熒光信號，在動物活體實時觀察乳腺癌局部成瘤及轉(zhuǎn)移情況；應用常規(guī)病理學

5、方法對乳腺癌原位及轉(zhuǎn)移動物模型進行評價和鑒定。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后的pEGFP-MDA-MB-231細胞穩(wěn)定、高效的表達EGFP，且增殖能力與MDA-MB-231相比，差異沒有顯著性；pEGFP-MDA-MB-231細胞裸鼠乳房墊原位接種的成功率高達60％，組織塊原位接種的成功率高達100％；第一代裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移率較低，待腫瘤長至適合大小時，取瘤組織采用外科手術原位接種的方法將瘤組織塊縫合在裸鼠乳房墊下，經(jīng)體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，裸鼠體內(nèi)傳

6、代3次后，腫瘤肝轉(zhuǎn)移能力明顯增強，至接種第6周后，幾乎所有的裸鼠均出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。通過常規(guī)病理學的方法，驗證了可視化高肝轉(zhuǎn)移動物模型的可靠性。 2.通過免疫磁珠分選技術分選出人臍帶血CD133+HPC，體外觀察其對乳腺癌細胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響 取健康、新鮮的臍帶血，利用人CD133免疫磁珠，采用免疫磁珠分選技術，分選出CD133+HPC，用含20％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)1-2周，與人乳腺癌MDA-MB

7、-231細胞共同培養(yǎng)24h后，采用MTT、Transwell的方法檢測CD133+HPC在體外培養(yǎng)條件下對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、黏附以及侵襲能力的影響。 結(jié)果：免疫磁珠分選技術分選的CD133+HPC陽性率高達80％以上，分選出的CD133+HPC體外培養(yǎng)1～2周，減少誘導分化，仍保留祖細胞的特征。取培養(yǎng)1-2周的CD133HPC與乳腺癌細胞共培養(yǎng)24h后，MTT法檢測CD133+HPC對乳腺癌細胞增殖能力的影響，

8、與腫瘤細胞單獨培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組腫瘤細胞增殖能力顯著增強，差異具有顯著性。CD133+HPC與乳腺癌細胞共培養(yǎng)24h，胰酶消化后接種于鋪有FN的96孔板，進行細胞基質(zhì)黏附試驗。MTT法檢測CD133+HPC對乳腺癌細胞黏附能力的影響，與腫瘤細胞單獨培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組腫瘤細胞黏附能力顯著增強，差異具有顯著性。采用Transwell小室觀察CD133+HPC對腫瘤細胞體外侵襲能力的影響，與腫瘤細胞單獨培養(yǎng)組相比，共培養(yǎng)組腫瘤細胞穿過基底

9、膜的能力顯著增強，差異具有顯著性。 3.流式細胞術、免疫組織化學技術觀察裸鼠腫瘤接種后不同時間VEGFR-1+HPC量的變化 在裸鼠乳腺癌原位接種前、接種后的不同時期頸椎脫臼法處死裸鼠，取裸鼠的肝組織，制成單細胞懸液后行流式細胞術檢查不同荷瘤時間裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC細胞含量的變化；送檢FCM后，剩余的裸鼠肝、肺組織常規(guī)石蠟包埋做成蠟塊，切成3μm厚的薄片，免疫組織化學染色行VEGFR-1、CD133陽性細胞

10、的檢測與分析，觀察VEGFR-1、CD133在裸鼠肝組織內(nèi)的定位和細胞簇形成情況，進一步驗證FCM檢驗結(jié)果。 結(jié)果：VEGFR-1+HPC的數(shù)量隨裸鼠乳腺癌原位接種的不阿時間而改變，乳腺癌接種后第2周、第4周、第6周裸鼠肝組織懸液中VEGFR-1+HPC的含量較接種前裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC的含量明顯增加，差異有顯著性；腫瘤接種后，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，裸鼠肝組織內(nèi)VEGFR-1+HPC在腫瘤細胞到達肝組織前即可被檢

11、測到其含量逐漸增加，各組之間的差異具有顯著性，與時間呈正相關。說明VEGFR-1+HPC提前腫瘤細胞到達預轉(zhuǎn)移部位，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，VEGFR-1+HPC的量逐漸增加，VEGFR-1+HPC提前到達預轉(zhuǎn)移部位，可能吸引腫瘤細胞的遷移；其含量隨著荷瘤時間的延長而增加，可能為腫瘤細胞的定居提供適宜的微環(huán)境。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：VEGFR-1、CD133陽性細胞在腫瘤細胞到達肝組織前即有表達，隨著裸鼠荷瘤時間的延長，陽性細胞數(shù)增

12、加且聚集成小的細胞簇，主要分布在裸鼠肝組織的被膜下、匯管區(qū)小血管旁等部位，與腫瘤轉(zhuǎn)移時腫瘤細胞最早到達形成轉(zhuǎn)移瘤的部位基本一致。 4.Westernblot檢測裸鼠腫瘤接種后不同時間肝組織內(nèi)轉(zhuǎn)移相關因子MMP-2、MMP-9的表達，初步探討VEGFR-1+HPC促進腫瘤轉(zhuǎn)移的機制 裸鼠組織標本送檢FCM后，剩余的裸鼠取100-200mg肝組織抽提組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并分裝，采用化學發(fā)光法進行Westernbl

13、ot檢測裸鼠腫瘤接種后不同時期肝組織內(nèi)MMP-2、MMP-9表達量的改變。 結(jié)果：在裸鼠腫瘤接種前以及接種后的不同時間，尚未形成轉(zhuǎn)移前組織內(nèi)的MMP-2、MMP-9等轉(zhuǎn)移相關因子隨著腫瘤接種和裸鼠荷瘤時間的延長而表達量增加。初步表明MMP-2、MMP-9可能在VEGFR-1+HPC促腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，在腫瘤細胞到達轉(zhuǎn)移灶前可能引起了局部微環(huán)境中的細胞及細胞外基質(zhì)的改變，降解了細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的到達和定居形成一個適宜的微環(huán)

14、境。 5.VEGFR-1、CD133陽性細胞在人乳腺癌組織標本中免疫組織化學方法檢測與分析，進一步驗證VEGFR-1+HPC在人乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。 收集南方醫(yī)院普外科2007年4月至2008年4月手術切除乳腺癌標本10例，10例區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌取白手術切除標本所附淋巴結(jié)，女性，患者年齡31～85歲。5例淋巴結(jié)反應性增生標本取自南方醫(yī)院普外科2007年8月至2008年5月。全部標本術前均未接受化療及放療，所有組織均用10

15、％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3μm厚切片，分別進行HE染色和免疫組織化學檢測。 結(jié)果：在乳腺癌患者的區(qū)域淋巴結(jié)可以檢測到CD133、VEGFR-1陽性細胞。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的區(qū)域淋巴結(jié)中CD133、VEGFR-1陽性細胞簇的量較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的區(qū)域淋巴結(jié)中CD133、VEGFR-1陽性細胞簇的量多，所形成的細胞簇包含的細胞數(shù)目較多。表明CD133、VEGFR-1陽性細胞可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關，可能可以做為預測乳腺癌

16、轉(zhuǎn)移的一個指標。 結(jié)論： 1.成功地穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP至人乳腺癌MDA-MB-231細胞，并采用體內(nèi)連續(xù)傳代的方法，建立了整體可視化乳腺癌高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移及臨床前的治療提供了一種良好的動物模型。 2.通過免疫磁珠分選技術可以得到純度較高的CD133+HPC，該細胞在體外培養(yǎng)的條件下，短期內(nèi)不會誘導分化，可以保留其祖細胞特性。CD133+HPC與乳腺癌細胞共培養(yǎng)可以顯著促進乳腺癌細胞的體外增殖、黏附

17、以及侵襲能力。 3.VEGFR-1+HPC在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用。VEGFR-1+HPC在乳腺癌細胞到達轉(zhuǎn)移灶前，提前到達預轉(zhuǎn)移部位，其含量隨著裸鼠荷瘤時間的延長而不斷增加，而且其在預轉(zhuǎn)移組織的表達部位與腫瘤轉(zhuǎn)移最先到達的部位基本一致?？赡芪橄侔┘毎倪w移，并為轉(zhuǎn)移瘤的形成提供適合定居的轉(zhuǎn)移微環(huán)境。 4.VEGFR-1+HPC促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用可能與轉(zhuǎn)移相關因子MMP-2、MMP-9等的表達增強有關。VE

18、GFR-1+HPC可能通過改變局部微環(huán)境中MMP-2、MMP-9等轉(zhuǎn)移相關因子的表達為轉(zhuǎn)移瘤細胞的定居與轉(zhuǎn)移瘤的形成提供適宜的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境。 創(chuàng)新： 1.建立了整體可視化乳腺癌原位接種高肝轉(zhuǎn)移動物模型，為乳腺癌的實驗研究提供了較理想的實驗工具. 2.成功篩選了CD133+HPC，發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌細胞具有促增殖、黏附及侵襲的作用3.在人癌實驗層次上證實了VEGFR-1+HPC對乳腺癌轉(zhuǎn)移的促進作用，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究提