人牙乳頭間充質細胞的分離培養(yǎng)及生長分化的實驗研究.pdf

1、牙髓—牙本質復合體構成牙齒的主體，是組織工程化牙齒構建的關鍵。因此，牙髓—牙本質復合體的建立將是今后組織工程牙研究的重點。本研究根據組織工程學的理論和方法，對構建組織工程化牙髓—牙本質復合體的種子細胞、支架材料等問題進行了系統(tǒng)性地研究，以期為牙髓-牙本質復合體的構建提供理論基礎和實驗技術路線。 本試驗的目的為：1、體外分離培養(yǎng)人牙乳頭間充質細胞(Humandentalpapillamesenchymalcells，hDPMCs)

2、，研究其細胞生物學性狀，為下一步的研究提供細胞來源。2、探討生長因子bFGF和IGF-Ⅰ對體外培養(yǎng)的hDPMCs增殖和分化的影響。3、探討hDPMCs向成牙本質細胞的定向分化機制。4、制備新型組織工程牙生物可降解支架材料，探討hDPMCs與可降解泡末支架材料復合生長情況，為構建組織工程化牙髓—牙本質復合體提供理論基礎和實驗方法。 本試驗的方法為：1、選擇3～4月胎齡的自然流產人胚胎，解剖牙乳頭，組織塊法培養(yǎng)hDPMCs，用波形絲

3、蛋白和細胞角蛋白雙重染色鑒定細胞；倒置顯微鏡下觀察細胞的體外生長特點；通過Ⅰ型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白免疫細胞化學染色，對細胞體外培養(yǎng)條件下的基質形成能力進行研究；通過茜素紅染色對細胞的礦化能力進行研究。2、采用四唑藍比色法觀察IGF-Ⅰ3和bFGF的不同濃度和不同作用時間對hDPMCs增殖的影響；采用改良酶動力學法觀察IGF-Ⅰ和bFGF的不同作用濃度和不同作用時間對hDPMCs的ALP活性的影響。3、用100μg/L濃度的IG

4、F-Ⅰ或10μg/L濃度的bFGF作用于hDPMCs，采用倒置顯微鏡、酶化學、免疫細胞化學和RT-PCR等方法從形態(tài)學和功能學方面檢測細胞的變化，探索hDPMCs向成牙本質細胞分化的機制。4、以DL-乳酸為原料采用溶液澆鑄—顆粒濾除法制備多孔PDLLA生物泡沫支架材料；用SEM、液體替代法等對材料的孔隙狀況進行測定，對材料的力學和降解性等進行研究；將細胞與PDLLA泡沫支架進行復合培養(yǎng)，用倒置顯微鏡、掃描電鏡、流式細胞儀等檢測細胞在材料

5、表面的生長增殖狀況；將細胞—支架復合體植入裸鼠背部皮下，術后4、8、16周處死裸鼠，取出植入體，用HE染色、Masson染色及DSPP免疫組織化學染色等方法觀察新生組織的牙向分化情況。 本試驗的結果為：1、用組織塊法培養(yǎng)的hDPMCs在體外生長良好，細胞呈梭形、三角形或多角形；細胞及分泌基質中的Ⅰ型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白表達陽性，說明細胞具有形成并分泌細胞外基質的能力；礦化誘導細胞可形成礦化結節(jié)，說明細胞具有形成鈣化基質

6、的能力。2、在0～100μg/L范圍內，bFGF和IGF-Ⅰ對hDPMCs增殖具有促進作用，bFGF的促增殖作用比IGF-Ⅰ大，兩種因子聯(lián)合作用時有協(xié)同作用；bFGF的最大有效濃度為10μg/L，IGF-Ⅰ的最大作用濃度為100μg/L。在0～7d培養(yǎng)時間內，bFGF對hDPMCs的ALP活性增加不明顯，IGF-Ⅰ對ALP活性隨時間的增加而顯著增加，bFGF與IGF-Ⅰ對增加ALP的活性有協(xié)同作用。3、IGF-Ⅰ組和IGF-Ⅰ+bFGF

7、組刺激的hDPMCs，7d后在倒置顯微鏡下可見細胞出現(xiàn)單一細胞漿突起，形態(tài)似成牙本質樣細胞；細胞的DSPP免疫細胞化學染色呈陽性表達；RT-PCR結果顯示細胞表達人成牙本質細胞特異性標志hDSPPmRNA。4、制備的PDLLA支架泡沫材料外觀呈乳白色；材料表面孔隙密布，孔隙間相互通連，微孔孔4徑為100～300μm，在大孔的孔壁上有許多微孔；材料孔隙率達90％左右；12周時的降解率達52％。細胞與PDLLA泡沫支架材料體外復合培養(yǎng)6h，

8、倒置顯微鏡可見材料周邊和孔隙邊緣有較多的細胞附著，隨培養(yǎng)時間的增加，細胞增多；掃描電鏡觀察培養(yǎng)1d后細胞附著于材料表面，呈梭形、三角形或多角形，細胞跨越微孔表面或長入微孔，培養(yǎng)8d后細胞密集生長，接觸緊密，部分區(qū)域有基質形成，部分細胞有單一胞漿突起；細胞在體外與材料復合生長后，細胞的生長曲線與流式細胞儀檢測結果表明該細胞與原代細胞無差異，說明細胞在材料上生長時，其增殖活動未受材料影響。細胞—支架復合體植入體內1周時，裸鼠創(chuàng)口Ⅰ期愈合；4

9、周取出標本體積與植入時接近；8周與16周時取出的標本體積較4周時明顯縮小，光澤度低，8周時可見有豐富的血管向植入物內長入。8周時和16周時可見材料區(qū)有X線阻射影。HE染色見：植入4周時材料部分吸收，大量細胞長入材料間隙內，有少量血管長入；8周時，材料進一步吸收，細胞及基質成分更多，可見較豐富的血管長入；16周時，細胞及基質成分進一步增多，仍見少量材料未吸收。Masson染色見：植入4周時細胞基質中有少量的膠原形成，未見硬組織形成；8周時

10、可見豐富的血管和較多膠原，有少量硬組織形成；16周時可見豐富的膠原和硬組織形成。DSPP的免疫組化染色：植入4周時形成的部分基質和細胞呈陽性染色；8周時基質和細胞成分增多，陽性染色的細胞和基質增多，表達增強；16周時陽性染色的細胞和基質成分進一步增多，表達更強。 本試驗的結論為：1、通過機械分離及貼壁法可獲得高純度的hDPMCs；hDPMCs有作為構建牙髓—牙本質復合體的種子細胞的應用前景。2、IGF-Ⅰ、bFGF對hDPMCs

11、的生長分化有重要調節(jié)作用；IGF-Ⅰ能誘導hDPMCs向功能性成牙本質細胞向分化；bFGF對IGF-Ⅰ有協(xié)同作用。3、PDLLA泡末支架材料具備良好的理化性能；材料與hDPMCs有較好的生物相容性；hDPMCs與材料復合體植入裸鼠體內，可形成牙本質樣結構，DSPP染色表達陽性。 5綜上所述，本研究在體外成功分離培養(yǎng)hDPMCs的基礎上，應用形態(tài)學、免疫細胞化學及掃描電鏡等方法對hDPMCs的生物學性狀、向成牙本質細胞向分化以及細