基于家系構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析青蝦生長特性及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、青蝦是長臂蝦科中有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的品種，其天然產(chǎn)量低，人工繁育難度很大，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常缺乏規(guī)格整齊的優(yōu)質(zhì)速生青蝦苗。不能規(guī)?；敝趁绶N供應(yīng)市場需求成為青蝦人工養(yǎng)殖的限制因素之一，而傳統(tǒng)采用捕撈已抱卵野生雌蝦在土塘中自然繁殖的育苗方式，獲得的蝦苗品質(zhì)和產(chǎn)量較低。為了標(biāo)準(zhǔn)化培育優(yōu)質(zhì)青蝦苗，進(jìn)一步提高青蝦產(chǎn)量，深入研究其調(diào)控生長的分子機(jī)理，本研究從青蝦生長特性入手，以構(gòu)建的全同胞家系為實(shí)驗(yàn)材料，排除生長過程中環(huán)境因素對生長產(chǎn)生的影響，從組織學(xué)角度

2、、核酸水平的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及小RNA組學(xué)，進(jìn)而從蛋白水平的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析，最后將各組學(xué)進(jìn)行聯(lián)合分析，由表及里的逐層對生長差異進(jìn)行分析，挖掘生長相關(guān)miRNA，最終獲得青蝦生長相關(guān)的主要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步培育青蝦高產(chǎn)速生新品系提供參考。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　?。?）采用在水族箱中模擬青蝦全人工繁育的仿生態(tài)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了全同胞家系，為室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化育苗構(gòu)建青蝦家系用于后續(xù)的選擇育種提供了技術(shù)參考。
　?。?）發(fā)現(xiàn)了與青蝦具親緣關(guān)

3、系的長臂蝦科一個(gè)未命名新種，暫定名為彌河蝦，并對其家系構(gòu)建進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，彌河蝦具備優(yōu)良生長特性，有望成為青蝦雜交改良的親本之一。
　　選用70日齡的相同飼養(yǎng)條件下，且處于蛻殼間期的青蝦全同胞家系，以體長差異分為2組，F(xiàn)G組為生長快速者，SG組為生長慢速者，進(jìn)行如下研究：
　　（3）組織學(xué)研究：以成年雄蝦和抱卵雌蝦的肝胰腺做參照，肝胰腺石蠟切片結(jié)果表明，F(xiàn)G組的肝胰腺細(xì)胞比SG組分化更快更完善，而SG組結(jié)締組織和胚

4、性細(xì)胞較多，反映出兩組在營養(yǎng)攝入及消化效率中的差異，推測FG組代謝更旺盛；同時(shí)，腹部肌肉的石蠟切片結(jié)果表明，F(xiàn)G組腹部肌肉橫切面的肌纖維直徑各參數(shù)均比SG組長，表明FG組的腹部肌肉生長速度更快。
　?。?）轉(zhuǎn)錄組研究：以整只蝦提取總RNA，進(jìn)行基于High-seq4000平臺的無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序以及基于High-seq2500平臺的小RNA測序，對差異表達(dá)基因與差異miRNA分別進(jìn)行篩選、GO富集及KEGG通路分析，預(yù)測了DE

5、M的靶基因，并對差異表達(dá)基因DEG與差異表達(dá)小RNA即DEM進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，進(jìn)而采用qRT-PCR方法對差異表達(dá)基因與miRNA相對表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　①無參考基因組轉(zhuǎn)錄組測序：FG組獲得22792166條clean reads，占總reads97.33％；SG組獲得22534835條clean reads，占總reads97.32%。在FG組與SG組中，共檢測到2739個(gè)基因顯著差異表達(dá)。以SG組為參照，F(xiàn)G組中有2116個(gè)基

6、因表達(dá)顯著上調(diào)，有623個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。選取15個(gè)差異表達(dá)基因?qū)Ω咄繙y序結(jié)果進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致，兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性（R2=0.901）。
　　②小RNA測序：在兩組中共檢測到592個(gè)差異表達(dá)的miRNA（含新發(fā)現(xiàn)的miRNA），其中有457個(gè)miRNA在兩個(gè)樣品中共同表達(dá)，有68個(gè)僅在FG組中表達(dá)，有67個(gè)僅在SG組中表達(dá)。另外，發(fā)現(xiàn)了84個(gè)差異表達(dá)的新miRNA，有15個(gè)新miRNA僅在

7、FG組中表達(dá)，有18個(gè)新miRNA僅在SG組中表達(dá)。選取11個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與高通量測序結(jié)果基本一致，相關(guān)系數(shù)為R2=0.972。
　?、坜D(zhuǎn)錄組與小RNA測序的關(guān)聯(lián)分析：關(guān)聯(lián)到14個(gè)主要的差異miRNA（上調(diào)表達(dá)5個(gè)、下調(diào)表達(dá)9個(gè)，包含2個(gè)全新的miRNA序列novel_22和novel_51），5個(gè)上調(diào)miRNA對45個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用，9個(gè)下調(diào)miRNA對137個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用

8、。
　?。?）蛋白組研究：為了從蛋白水平檢驗(yàn)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)差異，取用同家系同批次青蝦，采用Velos Pro離子阱與高場Orbitrap技術(shù)相結(jié)合的Thermo Scientific Orbitrap Elite組合式質(zhì)譜儀，對FG組與SG組的總蛋白酶解肽段，做質(zhì)譜分析，質(zhì)譜信息以轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)預(yù)測出的氨基酸庫為比對庫進(jìn)行搜庫注釋，以Maxfold change≥2與Anova p-value≤0.05為限制篩選條件，篩選到生長

9、快速組有8個(gè)蛋白表達(dá)比慢速組顯著升高，有104個(gè)蛋白表達(dá)比慢速組顯著降低。
　　轉(zhuǎn)錄組、小RNA與蛋白質(zhì)組的聯(lián)合分析，獲得了調(diào)控青蝦生長的3條調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　聯(lián)合分析結(jié)果表明：青蝦全同胞家系的生長差異是由于快慢兩組間基因轉(zhuǎn)錄效率的差異以及由酶類催化的代謝差異造成的，該過程受相關(guān)miRNA的調(diào)控。
　　獲得的3條青蝦生長相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式為：
　　網(wǎng)絡(luò)模式1：由sha-miR-21調(diào)控靶基因CFL，作用于肌動蛋白

10、解聚因子（cofilin/actin-depolymerizing factor）的表達(dá)，推測其在青蝦肌肉發(fā)育中起正調(diào)控作用。
　　網(wǎng)絡(luò)模式2：由sha-miR-21和hsa-miR-21-5p共同調(diào)控靶基因MCCC1的同源基因，影響β-甲基丁烯酰輔酶A羧化酶（methylcrotonoyl-CoA carboxylase）的表達(dá)，調(diào)控纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑，推測其在青蝦生長中對氨基酸的利用速率中起主要的正調(diào)控作用，促進(jìn)

11、青蝦生長。
　　網(wǎng)絡(luò)模式3：由新的miRNA成員novel_22調(diào)控靶基因Tspst的同源基因，作用于蛋白酶體β7亞基（proteasome subunit beta type-7），調(diào)控泛素蛋白酶體途徑，推測其在青蝦生長中對蛋白降解速率起主要調(diào)控作用，其蛋白表達(dá)下調(diào)時(shí)，利于同化作用，正調(diào)控青蝦生長。
　　sha-miR-21同時(shí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式1和網(wǎng)絡(luò)模式2，形成由氨基酸代謝關(guān)聯(lián)肌肉生長的網(wǎng)絡(luò)，在全同胞家系的生長中起重要作用。