新型融合蛋白PTD-GRB2-SH2和乳腺癌Ras信號轉導的相關研究.pdf

1、生長因子受體連接蛋白2（Grb2）是由一個中央的SH2結構域和兩個兩端的SH3結構域組成，一端通過SH2結構域激活受體酪氨酸激酶（RTK），另一端通過SH3結構域結合鳥嘌呤核苷酸交換因子（SOS），進一步激活下游通路信號分子，啟動MAPK級聯(lián)反應，參與到腫瘤信號轉導過程中。
　　本實驗從Ras信號通路中的重要分子Grb2的SH2結構域切入，以基因到蛋白水平兩種不同層次的干預方式為結合點，重點闡明Grb2-SH2結構域在乳腺癌細胞中

2、的功能和地位，并采取基因重組的方法構建含有Grb2－SH2結構域和PTD結構域的融合蛋白，構建好的融合蛋白通過PTD結構域穿膜進入到細胞內，根據SH2結構域結合底物的活性競爭結合底物分子的機制影響乳腺癌的增殖信號轉導過程，從而達到干預腫瘤細胞生物學行為的目的。
　　實驗主要分為三部分：
　　1.構建含有Grb2的SH2結構域的原核融合蛋白載體pET-16b-PTD-Grb2–SH2及其突變體對照載體，通過酶切、DNA電泳及質

3、粒測序鑒定分子量和序列均正確無誤后，用IPTG誘導原核蛋白表達，并經過鎳柱純化獲取原核融合蛋白 pET-16b-PTD-GRB2-SH2，SDS-PAGE凝膠分析此純化蛋白確有表達并且分子量與預期一致。
　　2.將純化好的蛋白及其突變體對照蛋白加到培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231細胞中，通過MTT實驗、Transwell腫瘤遷徙實驗、流式細胞凋亡檢測和EdU增殖實驗證明原核融合蛋白PTD-GRB2-SH2對乳腺癌

4、細胞系MCF7和MDA-MB-231細胞的增殖以及遷移能力都有一定的抑制作用，但對凋亡有促進作用。
　　3.應用Gateway系統(tǒng)構建含有Grb2的SH2結構域的真核融合蛋白載體plenti-PTD-Grb2–SH2及其突變體對照載體，通過酶切、DNA電泳及質粒測序鑒定分子量與序列正確無誤后，利用三種慢病毒包裝質粒轉染后收取含病毒顆粒的上清，感染T淋巴瘤細胞系Jurkat細胞，用藥物Blasticidin篩選穩(wěn)定轉染細胞株，Wes