18O標記技術改良和分析工具開發(fā)及在鼻咽癌轉移相關膜蛋白組研究中的應用.pdf

1、蛋白質組學已經(jīng)成為當前生命科學研究的重要內容，已廣泛應用于生命科學各個領域。由于基因在轉錄、翻譯后產(chǎn)生蛋白質的過程中，存在著轉錄水平、翻譯水平的調控，同時還存在著蛋白質的翻譯后修飾，因而蛋白質組研究要比基因組研究復雜得多，蛋白質組學對技術的依賴性和要求也遠超過基因組學。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準確性的方法和技術一直是蛋白質組學研究面臨的挑戰(zhàn)。
　　 隨著蛋白質研究技術和方法的進步，蛋白質組學研究呈現(xiàn)出新的特點：即由原來以蛋

2、白質表達譜研究為中心逐步向蛋白質精確定量和功能研究轉變。目前以穩(wěn)定同位素標記技術為代表的定量蛋白質組學技術已逐漸成為了蛋白質組研究的新技術之一。但定量蛋白質組學技術還處于發(fā)展階段，其研究技術和相關分析工具有待改進和完善。
　　 18O標記技術是較早應用于定量蛋白質組學研究的技術之一。該技術以酶解反應動力學原理為基礎，通過酶催化反應進行蛋白質的18O標記。18O標記技術具有操作簡單、條件溫和、沒有副產(chǎn)物等獨特優(yōu)勢。但18O技術也存

3、在如下不足：(1)在酶存在的情況下標記容易丟失，從而影響定量分析的準確性；(2)獲得的數(shù)據(jù)分析相對復雜；
　　 (3)定量分析工具不足。
　　 膜蛋白在細胞與細胞識別、信號轉導、物質轉運等方面發(fā)揮重要功能。膜蛋白異常表達常導致細胞信號轉導、細胞粘附和運動等方面的改變，并與腫瘤侵襲和轉移密切相關。因此，膜蛋白質組研究己成為腫瘤蛋白質組研究的重要內容。
　　 基于上述考慮，我們首先對18O標記方法進行了優(yōu)化和改進。1

4、8O標記中標記丟失是該方法的主要的弱點。針對這一點，我們采用固相胰酶作為標記酶，標記反應結束后，通過Ziptip對固相胰酶進行過濾去除，分析過濾后的樣本在不同pH條件下標記的穩(wěn)定性。結果顯示，與熱處理法比較，Ziptip過濾法能顯著提高18O標記的穩(wěn)定性。在連續(xù)三天的檢測中未發(fā)現(xiàn)明顯的標記丟失現(xiàn)象。進一步分析了Ziptip過濾法對定量分析結果的的影響，結果顯示在連續(xù)三天的檢測中肽段的定量差異均小于5％。對過濾樣品進行等電聚焦(IEF)分

5、離后也顯示18O標記無明顯丟失，進一步的分析也顯示肽段標記效率與肽段分子量和理論等電點無明顯相關性。另外，Ziptip過濾法所處理樣品均為10-20μl，因此，我們優(yōu)化和改進的18O標記方法能夠用于微量蛋白樣本的定量分析，這對臨床稀缺樣本，如激光捕獲顯微切割(LCM)純化的組織樣本的分析具有重要意義。
　　 我們針對目前18O蛋白定量分析工具不足的現(xiàn)狀開發(fā)了OxyQuantToolkit工具。該工具采用java語言開發(fā)，具有跨平

6、臺的優(yōu)勢。分析工具的功能涵蓋了18O標記技術中數(shù)據(jù)處理的多個環(huán)節(jié)，通過該工具可自動完成18O標記定量分析中的大量計算任務，分析工具可輸出定量分析結果。同時分析工具還具有數(shù)據(jù)整理，轉存方面的功能，這對有效管理數(shù)據(jù)也有積極作用。另外，該工具還包含了質譜數(shù)據(jù)的可視化編程包，可進行質譜通用格式文件mzxml的可視化查看。OxyQuantToolkit分析工具的開發(fā)為基于18O標記定量蛋白質組學技術的推廣與應用奠定了基礎。
　　 在標記方

7、法改進和分析工具開發(fā)的基礎上，我們利用改進盼18O標記技術對高轉移鼻咽癌細胞5-8F與不轉移鼻咽癌細胞6-10B的膜蛋白組進行了定量分析。結果共鑒定了503種蛋白質，其中44％為膜蛋白，89.7％的蛋白質定量結果在0.5-2之間(均值為1.13)。對重復鑒定的395個蛋白的定量分析結果進行統(tǒng)計學分析，結果顯示其標準差均值為0.06，具有較高的重復性。結果表明，改進的18O標記技術具有重要的應用價值。另外，參照文獻標準(差異變化兩倍以上、

8、在三次重復實驗中均被鑒定的蛋白質)，我們對5-8F與6-10B細胞的膜蛋白組進行了比較，獲得了31個差異表達的膜蛋白，其中在5-8F中表達下調的6個，表達上調的25個。生物信息分析顯示，其中一些差異蛋白如ITGB1、EphA2與細胞粘附、腫瘤侵襲和轉移密切相關。這些差異蛋白質的發(fā)現(xiàn)為研究鼻咽癌轉移機制以及鼻咽癌轉移的防治提供了靶標。進一步比較5-8F與6-10B細胞的膜磷酸化蛋白組的差異，發(fā)現(xiàn)EphA2促轉移的關鍵位點S897磷酸化水平

9、在兩株細胞存在差異，且EGFR能夠磷酸化該位點，這提示EGFR可能通過活化EphA2促進鼻咽癌轉移。
　　 本研究建立了基于Ziptip過濾去除固相胰酶的改良18O標記方法。該方法具有標記穩(wěn)定、定量分析準確結果以及適合微量樣本分析的特點；開發(fā)了與平臺無關的基于18O標記技術的定量蛋白質組分析工具OxyQuantToolkit，為18O標記技術的推廣和應用打下了基礎，并開發(fā)了基于java的質譜數(shù)據(jù)可視化編程包，實現(xiàn)了mzxml文件