pGM-neu1和pGM-neu2載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：選擇C—erbB—2（neu）基因中編碼兩個(gè)HLA—A2限制性CTL抗原肽表位p106—114，p369—377的基因片段，將它們分別克隆至pGM—T載體，構(gòu)建克隆載體pGM—neul（包含p106—114片段）和pGM—neu2（包含p369—377片段），為進(jìn)一步構(gòu)建肺癌核酸疫苗及后續(xù)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：①小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞株的培養(yǎng)：在含10%胎牛血清及雙抗（青霉素100 U/ml，鏈霉素100μg/ml）

2、的RPMI—1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。②免疫組化方法檢測小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞中C—erbB—2的表達(dá)：將對數(shù)生長期的小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞膜染成棕黃色顆粒即為C—erbB—2表達(dá)。③neul（包含p106—114片段）、neu2（包含p369—377片段）的擴(kuò)增：用TRIzol法提取Lewis細(xì)胞總RNA，用RT—PCR方法擴(kuò)增neul、neu2

3、基因片段，PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。④PCR產(chǎn)物的回收純化：用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。⑤感受態(tài)菌的制備：大腸桿菌DH5α經(jīng)CaCl2溶液及短暫熱休克處理后，即成為感受態(tài)菌。⑥pGM—neu1和pGM—neu2載體的構(gòu)建：目的片段與pGM—T載體在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接重組，構(gòu)建pGM—neu1和pGM—neu2載體。⑦連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)菌，通過藍(lán)白篩選挑選重

4、組質(zhì)粒。⑧重組陽性克隆的PCR鑒定：挑選平板上的白色菌落（陽性重組子）作為模板，分別用neu1、neu2的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4%瓊脂糖凝膠電泳檢測重組陽性克隆中是否含有目的片段。⑨pGM—neul和pGM—neu2的提取及純化：培養(yǎng)PCR鑒定的陽性菌落，用質(zhì)粒小提試劑盒提取及純化陽性重組子。⑩DNA測序鑒定：將含有目的基因片段的陽性重組質(zhì)粒送交Invitrogen公司進(jìn)行DNA序列測定。 結(jié)果：⑴免疫組化染色檢測C—erbB—

5、2的表達(dá)：結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞有明顯深棕色，表現(xiàn)出較強(qiáng)陽性，陽性信號位于細(xì)胞膜，說明C—erbB—2在小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞中有較高表達(dá)。⑵neu1、neu2片段的擴(kuò)增：從小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞中提取總RNA，用RT—PCR的方法獲得cDNA，以其為模板，PCR法擴(kuò)增neu1和neu2，產(chǎn)物進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳，在100bp—200bp之間可見兩條特異擴(kuò)增帶，片段大小與理論預(yù)期相符。⑶重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定：重組陽性

6、克隆的PCR鑒定：白斑菌落分別擴(kuò)增出約164bp和157bp的條帶，與目的片段相符；DNA測序鑒定：將含有目的基因片段的陽性重組質(zhì)粒送交Invitrogen公司進(jìn)行DNA序列測定，結(jié)果與GeneBank中小鼠C—erbB—2的基因序列一致。 結(jié)論：①C—erbB—2在小鼠Lewis肺腺癌細(xì)胞中有較高表達(dá)。②成功構(gòu)建了克隆載體pGM—neu1和pGM—neu2，為進(jìn)一步構(gòu)建肺癌neu1、neu2核酸疫苗及后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基