抗炎抗凝雙效融合蛋白TAP-SSL5對(duì)血小板功能的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是血管壁在受到氧化脂質(zhì)或感染等各種因素?fù)p傷的基礎(chǔ)上，發(fā)生的慢性炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)與凝血系統(tǒng)激活在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。重組融合蛋白TAP-SSL5是將能夠特異性地與粒細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)相結(jié)合，并能顯著抑制粒細(xì)胞在含P-選擇素(

2、P-selectin)表面黏附的蛋白質(zhì)SSL5(staphylococcal superantigen-like protein-5，金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5)作為引導(dǎo)兼功能分子，與能夠抑制凝血因子Xa(factorXa，F(xiàn)Xa)活性的分子—蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide，TAP)進(jìn)行融合而制備出的具有抗炎抗凝雙效功能的融合蛋白。本課題組的前期研究表明，SSL5還能與血小板表面GPIbα結(jié)合，本課

3、題進(jìn)一步研究了融合蛋白TAP-SSL5對(duì)血小板功能的影響，旨在較全面地評(píng)價(jià)融合蛋白TAP-SSL5的功能。而OS-1是GPIbα的一種拮抗性多肽，能夠抑制vWF-A1與GPIbα-Fc的結(jié)合，從而抑制血小板在激活血管內(nèi)皮表面的黏附；本研究還進(jìn)一步采用OS-1為對(duì)照，分析TAP-SSL5對(duì)體內(nèi)血栓形成的影響。
　　 研究方法：
　　 1、構(gòu)建融合蛋白TAP-SSL5表達(dá)載體：按本課題組前期已建立的方法，進(jìn)行TAP-SSL5

4、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染以及該融合蛋白的純化。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn)部分：靜脈血采自至少兩周之內(nèi)未服用過任何藥物的健康志愿者，用枸櫞酸鈉(與全血的體積比為1:9)抗凝；進(jìn)行離心后得到富含血小板的血漿(platelet-rich plasma，PRP)，以1×Tyrode’緩沖液平衡CL-2B瓊脂糖凝膠柱后，將PRP以該凝膠柱過濾，得到凝膠過濾的血小板(gel-filtered platelets，GFP)。用流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)融合蛋

5、白TAP-SSL5和血小板結(jié)合的情況，并檢測(cè)TAP-SSL5和OS-1對(duì)小鼠抗人GPIbα單克隆抗體(HIP1)與血小板結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面CD62P的表達(dá)和PAC-1的結(jié)合量，以觀察TAP-SSL5和OS-1對(duì)血小板的激活作用；采用Chrono-Log血小板聚集儀檢測(cè)融合蛋白TAP-SSL5對(duì)全血(或PRP)血小板聚集的影響；并觀察融合蛋白TAP-SSL5對(duì)血小板在纖維蛋白原表面靜態(tài)黏附的影響。采用JC-1

6、試劑盒和FACS檢查，進(jìn)一步研究了OS-1對(duì)血小板線粒體膜電位的影響，以期闡明OS-1對(duì)血小板功能影響的機(jī)制。
　　 3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：選取昆明小鼠，檢測(cè)TAP-SSL5對(duì)小鼠尾部出血時(shí)間的影響。經(jīng)尾靜脈一次性注射不同劑量的TAP-SSL5，在距離小鼠尾尖5mm處截?cái)?，浸入溫生理鹽水中，記錄出血時(shí)間；采用氯化鐵誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈血栓形成模型，研究OS-1的抗血栓形成作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、融合蛋白TAP-

7、SSL5可與血小板結(jié)合，并能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HIP1與血小板的結(jié)合，提示TAP-SSL5可與血小板表面的GPIba結(jié)合；終濃度為30mg/L的TAP-SSL5能激活血小板，使人血小板表面CD62P的表達(dá)和PAC-1的結(jié)合量明顯增加，其陽性率分別為90.4%(p<0.001)和66.3%(p<0.01)；終濃度為10mg/L、30mg/L的TAP-SSL5均可引起血小板的顯著聚集；30 mg/L TAP-SSL5可促進(jìn)血小板在纖維蛋白原表面的靜

8、態(tài)黏附；OS-1可抑制HIP1與血小板的結(jié)合；30μM OS-1可激活血小板，使人血小板表面CD62P的表達(dá)增加(陽性率39%)和PAC-1的結(jié)合量上升(陽性率40.5%)；而OS-1對(duì)血小板線粒體膜電位無明顯影響。
　　 2、單次尾靜脈注射10mg/kg的TAP-SSL5，能夠顯著延長(zhǎng)小鼠尾部出血時(shí)間，由對(duì)照組的(647.1±33.7)s延長(zhǎng)至(753.6±127.3)s(p<0.01)，而常規(guī)劑量組(3mg/kgTAP-SS

9、L5)尾部出血時(shí)間為(612.8±79.1)s，與對(duì)照組相比無顯著差異(p>0.05)。采用氯化鐵誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈血栓形成模型的研究結(jié)果顯示，DMSO溶劑對(duì)照組的血栓重量為(17.3±5.6)mg，單次靜脈注射1.22 mg/kg或3.66mg/kg的OS-1，可顯著抑制FeCl3誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈的血栓形成，血栓重量分別為(10.5±3.5)mg(與對(duì)照組相比，p<0.05)和(8.2±4.l)mg(與對(duì)照組相比，p<0.01)。<

10、br>　　 結(jié)論：
　　 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5與血小板GPIbα結(jié)合的功能，這提示TAP-SSL5可能通過抑制GPIbα與vWF的相互作用，而進(jìn)一步增強(qiáng)其抗血栓作用；但TAP-SSL5與GPIbα的結(jié)合也可導(dǎo)致其在高濃度情況下激活血小板和延長(zhǎng)出血時(shí)間。OS-1作為GPIbα的拮抗性多肽，可抑制氯化鐵誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈血栓形成，但同時(shí)對(duì)血小板也有一定的激活效應(yīng)；體外研究顯示，OS-1對(duì)血小板線粒體膜電位無明顯影