選擇性五羥色胺再攝取抑制劑對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)和5-HT2B受體RNA編輯的影響.pdf

1、前言：抑郁癥是一種常見(jiàn)的心理障礙,不僅發(fā)病率和致死率高,還給病人家庭及社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)是目前治療抑郁癥的常用藥物,對(duì)于其藥理作用機(jī)制,傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為是抑制突觸5-HT的再攝取而增加突觸內(nèi)該遞質(zhì)的濃度,從而增強(qiáng)5-HT信號(hào)傳導(dǎo)。然而這一觀點(diǎn)卻很難解釋選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)很快增加抑郁癥患者大腦突觸間隙的5-HT濃度,卻需數(shù)周后才能改善患者臨床癥狀的現(xiàn)象。這表明選擇性五羥色

2、胺再攝取抑制劑(SSRIs)的藥物作用機(jī)制除了增加細(xì)胞外5-HT濃度外,可能還有別的靶點(diǎn)。
　　 星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一種細(xì)胞,其體積占大腦的20-50％。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起著支持和營(yíng)養(yǎng)等作用,此外有研究表明它還參與腦的代謝,同時(shí)跟神經(jīng)元也有廣泛的聯(lián)系。隨著對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能研究的深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明它在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,而且可能是抗抑郁藥物作用的新靶點(diǎn)。
　　 cPLA2是一種

3、鈣離子依賴(lài)性胞漿型磷脂酶,它能水解細(xì)胞膜磷脂中sn-2位點(diǎn)的酰酯鍵,產(chǎn)生溶血磷脂和游離脂肪酸(例如花生四烯酸)?；ㄉ南┧岬尼尫藕痛x對(duì)大腦的可塑性和信號(hào)傳導(dǎo)起著重要的作用。cPLA2a亞型是cPLA2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的主要表達(dá)類(lèi)型。我們最近發(fā)現(xiàn)氟西汀是星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體的特異性激動(dòng)劑,氟西汀慢性作用星形膠質(zhì)細(xì)胞可引起cPLA2a表達(dá)的升高,并且該上調(diào)作用需要經(jīng)5-HT2B受體介導(dǎo)的EGFR間接激活途徑參與。如果氟西汀對(duì)星形膠

4、質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體的激動(dòng)作用在其治療抑郁癥的過(guò)程中發(fā)揮作用的話,那么其他四種傳統(tǒng)的五羥色胺再攝取抑制劑,帕羅西汀,舍曲林,氟伏沙明,西酞普蘭,其治療濃度藥物慢性作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí),對(duì)5-HT2B受體和cPLA2a的作用可能跟氟西汀一致。
　　 RNA編輯(RNA editing),是轉(zhuǎn)錄后的RNA前體經(jīng)過(guò)修飾和加工使RNA所攜帶的遺傳信息發(fā)生改變的過(guò)程。RNA編輯的發(fā)生主要是通過(guò)作用于RNA的腺苷酸脫氨酶(ADARs)對(duì)R

5、NA堿基水解脫氨而進(jìn)行,其中腺苷(A)到肌苷(I)的轉(zhuǎn)變(adenosine-inosine)是編輯的主要形式。腺苷(A)經(jīng)過(guò)編輯后變成了肌苷(I),而肌苷(I)在翻譯的過(guò)程中被誤認(rèn)為是鳥(niǎo)苷(G),這樣就引起遺傳信息的改變,最終導(dǎo)致相應(yīng)編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。ADARs有三個(gè)亞型,即ADAR1、ADAR2和ADAR3。5-HT2C受體是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)存在RNA編輯現(xiàn)象的G蛋白偶聯(lián)受體,且編輯后受體功能下調(diào)。5-HT2B受體同5-

6、HT2C受體都屬于5-HT2受體家屬,其基因序列有高度的相似性,存在發(fā)生RNA編輯的可能,而我們最近發(fā)現(xiàn)氟西汀處理3天的星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體mRNA表達(dá)升高,但其功能卻下調(diào)了,這進(jìn)一步提示我們5-HT2B受體可能存在RNA編輯現(xiàn)象。
　　 本課題主要在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,研究選擇性五羥色胺再攝抑制劑(SSRIs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制。即:①分析比較五種選擇性五羥色胺再攝抑制劑(SSRIs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPL

7、A2a表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;②研究該作用是否需要激活5-HT2B受體;③選擇性五羥色胺再攝抑制劑(SSRIs)氟西汀慢性作用星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)5-HT2B受體和ADARs表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;④氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體RNA編輯的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：
　　 采用原代培養(yǎng)的小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。①分別用選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)帕羅西汀,舍曲林、氟伏沙明、西酞普蘭處理細(xì)胞1-4周,用RT-PCR和免疫印跡方法

8、檢測(cè)藥物對(duì)cPLA2a亞型的作用;②用帕羅西汀,并加入SB204741(5-HT2B受體抑制劑)或AG1478(EGF受體酪氨酸激酶抑制劑)或GM6001(Zn2+介導(dǎo)的金屬蛋白酶抑制劑)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞,然后用免疫印跡方法檢測(cè)cPLA2a的表達(dá)。③10μM氟西汀處理星形膠質(zhì)細(xì)胞3天,然后用RT-PCR和免疫印跡方法檢測(cè)5-HT2B受體和ADARs的表達(dá)。④10μM氟西汀處理星形膠質(zhì)細(xì)胞3天,用AMRS-PCR檢測(cè)5-HT2B受體潛在位

9、點(diǎn)的RNA編輯。
　　 使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)的上調(diào)作用。1μM的帕羅西汀、氟伏沙明、舍曲林慢性作用可以上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a的表達(dá),而西酞普蘭在0.1-0.5μM即可引起相同效果,這些藥物濃度跟藥物的治療濃度

10、相近。
　　 2、帕羅西汀引起星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)的升高需要由5-HT2B受體介導(dǎo),并需激活Zn2+依賴(lài)性金屬蛋白酶,EGF受體。5-HT2B受體抑制劑(SB204741)、EGF受體酪氨酸激酶抑制劑(AG1478)、金屬蛋白酶抑制劑(GM6001)和ERK1/2磷酸化抑制劑(U0126)均抑制了帕羅西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)的上調(diào)作用。
　　 3、氟西汀慢性作用可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體和ADA

11、R2表達(dá)的升高,但其ERK1/2磷酸化水平下降。
　　 在對(duì)照組(生理鹽水處理細(xì)胞三天),10μM氟西汀處理細(xì)胞20分鐘,其ERK1/2磷酸化水平顯著增加,但是實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)1μM或10μM氟西汀作用3天后,再用10μM氟西汀急性作用細(xì)胞20分鐘,ERK1/2磷酸化不變。此外,10μM氟西汀處理3天的星形膠質(zhì)細(xì)胞,其5-HT2B受體和ADAR2表達(dá)升高。
　　 4、氟西汀慢性作用可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體RNA編輯

12、,并且該作用需要ADAR2的參與。
　　 原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的5-HT2B受體有8個(gè)位點(diǎn)存在RNA編輯現(xiàn)象,10μM氟西汀處理星形膠質(zhì)細(xì)胞3天后,有五個(gè)位點(diǎn)編輯的比例升高,而用RNA干擾技術(shù)下調(diào)ADAR2表達(dá)后,氟西汀對(duì)編輯位點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用被阻斷。
　　 討論：
　　 1、選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a的調(diào)節(jié)作用在正常成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)五羥色胺轉(zhuǎn)載體(SER

13、T),本實(shí)驗(yàn)中原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞也不表達(dá)SERT,這表明SSRIs藥物對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用不可能通過(guò)作用于SERT。原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)dBcAMP處理分化成熟后,大量表達(dá)5-HT2B受體,并且Ditte Lovatt等利用流式細(xì)胞儀(FACS)技術(shù)從小鼠腦內(nèi)分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)5-HT2B受體。現(xiàn)在的關(guān)鍵問(wèn)題是治療劑量的選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)是否通過(guò)激活腦內(nèi)5-HT2B受體而發(fā)揮抗抑郁作用?功能失調(diào)性態(tài)度

14、是評(píng)估抑郁癥情緒的一項(xiàng)指標(biāo),其值的高低能評(píng)價(jià)抑郁的嚴(yán)重程度。Meryer等通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)5-HT2B受體的激動(dòng)劑氟苯丙胺降低了健康個(gè)體的功能失調(diào)性態(tài)度,這表明藥物對(duì)5-HT2B受體的激活同抗抑郁作用密切相關(guān)。我們將SSRIs治療劑量的血藥濃度跟引起星形膠質(zhì)細(xì)胞cPLA2a表達(dá)變化的作用濃度進(jìn)行了比較,推測(cè)在長(zhǎng)期應(yīng)用SSRIs類(lèi)藥物治療時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞的5-HT2B受體可能是藥物的一個(gè)作用靶點(diǎn)。
　　 大鼠經(jīng)氟西汀長(zhǎng)期作用后,腦內(nèi)c

15、PLA2a表達(dá)升高。cPLA2a激活后,膜磷脂sn-2位置特異性釋放花生四烯酸。花生四烯酸釋放增多是抑郁癥患者應(yīng)用SSRIs治療后的一個(gè)已知的生物學(xué)作用?；ㄉ南┧崮軌虼蟠蟮脑鰪?qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖代謝和糖原分解。星形膠質(zhì)細(xì)胞的葡萄糖代謝占整個(gè)腦的30％?；ㄉ南┧釋?duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的葡萄糖代謝的影響在抑郁癥的病理生理和藥理治療學(xué)中均有重要作用。抑郁癥病人腦的多個(gè)區(qū)域的葡萄糖代謝均有下降,特別是在額顳部位,抑郁癥的嚴(yán)重程度跟腦內(nèi)葡萄糖代謝

16、的減退程度密切相關(guān)?？挂钟羲庍x擇性五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)能夠使減退的葡糖糖代謝回復(fù)正常。
　　 2、氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體RNA編輯的調(diào)節(jié)作用本研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的5-HT2B受體存在RNA編輯現(xiàn)象,氟西汀慢性作用可以上調(diào)位點(diǎn)發(fā)生編輯的程度,并且該作用需要ADAR2的參與。5-HT2B受體和5-HT2C受體同屬于G蛋白偶聯(lián)受體。在G蛋白偶聯(lián)受體家屬中,過(guò)往研究只發(fā)現(xiàn)5-HT2C受體存在RNA編輯,而我

17、們首次證明了5-HT2B受體也存在RNA編輯現(xiàn)象。先前我們報(bào)道了氟西汀慢性作用星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體可能跟其治療抑郁癥的藥理機(jī)制相關(guān),并且在以往對(duì)5-HT2C受體研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦內(nèi)5-HT2C受體mRNA的各編輯位點(diǎn)的編輯百分比較正常者有變化,而且這種變化經(jīng)過(guò)持續(xù)抗抑郁藥治療后可能會(huì)恢復(fù)到原水平。因此我們推測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞5-HT2B受體的RNA編輯在抑郁癥的病理過(guò)程中可能發(fā)揮著重要角色,而氟西汀對(duì)5-HT2B受體RNA

18、編輯的調(diào)節(jié)作用可能是其抗抑郁藥理機(jī)制的重要組成部分。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ADAR2表達(dá)較多,而ADAR1很少,氟西汀慢性作用可以上調(diào)ADAR2的表達(dá)而對(duì)ADAR1沒(méi)有作用;此外,我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)ADAR2的表達(dá)后,氟西汀對(duì)5-HT2B受體RNA編輯的調(diào)節(jié)作用即被阻斷,這些結(jié)果均表明氟西汀對(duì)5-HT2B受體RNA編輯的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)ADAR2介導(dǎo)的。
　　 本課題所研究的星形膠質(zhì)細(xì)胞都是原代培養(yǎng)的,而不是

19、直接來(lái)自在體。不過(guò),我們?cè)谂囵B(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中加入了dBcAMP(雙丁酰環(huán)腺苷酸)來(lái)替代在體的去甲腎上腺能信號(hào)系統(tǒng),達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞分化成熟,從而使培養(yǎng)的細(xì)胞跟體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞相似。
　　 結(jié)論：
　　 1、在原代培養(yǎng)的小鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中,五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)帕羅西汀、氟伏沙明、舍曲林和西酞普蘭對(duì)cPLA2a表達(dá)的慢性調(diào)節(jié)作用跟氟西汀相似,1μM帕羅西汀、氟伏沙明、舍曲林即上調(diào)cPLA2a的表達(dá);而西酞普蘭在