大鼠原發(fā)性肝癌腫瘤細胞與骨髓造血干細胞在肝癌個體化治療應(yīng)用中的實驗研究.pdf

1、背景:
　　 以肝切除為代表的外科治療仍是原發(fā)性肝癌的首選治療方法。但由于原發(fā)性肝癌的早期發(fā)現(xiàn)存在困難,肝癌切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率高達60％以上,切除術(shù)后的綜合治療在原發(fā)性肝癌的治療中仍然占有重要的地位。化療是綜合治療的主要手段之一,而各種針對原發(fā)性肝癌的臨床化療總體有效率僅為18.2％～47％,并且進展緩慢。提供切實可行的個體化化療方案成為臨床工作者面對原發(fā)性肝癌治療上的迫切需要。
　　 隨著近年來腫瘤干細胞(TSC)理

2、論的確立,對于實體腫瘤的治療有了新的認識:TSC是腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為的核心,是腫瘤細胞成瘤能力的決定因素。只要存在腫瘤干細胞,腫瘤就難以治愈。本實驗室的前期研究中在大鼠原發(fā)性肝癌已經(jīng)初步鑒定了具備TSC特征(極強的致瘤能力和自我更新并多向分化)的腫瘤細胞亞群。由此如果能夠建立一種針對原發(fā)性肝癌腫瘤干細胞的個體化化療方案,靶向殺傷腫瘤干細胞,將有希望在原發(fā)性肝癌的化療進展上取得突破。
　　 目前對于包括肝癌

3、在內(nèi)的絕大多數(shù)實體瘤來說,缺乏鑒定TSC的統(tǒng)一標準,而分離出純度高的TSC,直接進行藥敏實驗的技術(shù)難度、成本都比較大。較多研究表明,肝干細胞是肝細胞癌和膽管癌的祖細胞。來源于骨髓干細胞的肝卵圓細胞(Hepaticovalcell,HOC)具備肝臟干細胞性質(zhì),是肝癌干細胞的對應(yīng)成體干細胞。卵圓細胞不僅具有同骨髓干細胞相似的表面標志,如CD34、Thy-1(CD90)、c-kit(CD117),并且在耐藥機制上也類似干細胞。骨髓干細胞分為造

4、血干細胞和間充質(zhì)干細胞,相比較TSC而言易于分離鑒定,藥敏實驗的可行性較高?；谏鲜隼碛?本課題利用腫瘤干細胞與骨髓干細胞的關(guān)系,重點研究骨髓干細胞在針對肝癌干細胞個體化化療的藥物敏感實驗中的應(yīng)用。
　　 目的:研究大鼠骨髓造血干細胞與大鼠原發(fā)性肝癌細胞藥敏與肝癌細胞成瘤能力的相關(guān)性；探討利用造血干細胞,進行針對肝癌干細胞藥物敏感實驗的可能性。并研究了藥物對骨髓間充質(zhì)干細胞、肝癌細胞和HepG2細胞的藥敏差異。
　　 方

5、法:30只雄性清潔級SD大鼠應(yīng)用0.025％二乙基亞硝胺水溶液飼喂24周建立大鼠原發(fā)性肝癌模型,選取誘癌成功大鼠8只,用組織塊法分離培養(yǎng)原代肝癌細胞；用免疫磁珠法分離骨髓造血干細胞,流式細胞儀檢測傳代細胞表面標志CD34。篩選五種不同作用機制抗腫瘤藥物表阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑作用24小時后,SRB法分別檢測化療藥物對造血干細胞與肝癌細胞的抑制率。同時藥物作用后的肝癌細胞接種至裸鼠,6周后測量移植瘤重量觀察

6、其成瘤實驗的差異,對模型大鼠造血干細胞、腫瘤細胞抑制率與化療藥物作用后腫瘤細胞移植裸鼠后的成瘤重量分別進行相關(guān)性分析。另取原代培養(yǎng)腫瘤細胞與間充質(zhì)干細胞,同時與HepG2細胞系細胞,SRB法進行藥物敏感實驗,觀察藥物敏感性的差異。
　　 結(jié)果:(1)表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對肝癌大鼠造血干細胞抑制率分別為26.44±3.14、29.72±5.05、25.98±3.34、26.91±2.70、27.21

7、±3.93；對肝癌細胞抑制率分別為:44.43±5.80、56.53±6.50、41.93±7.31、45.53±4.65、54.07±5.02。表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對肝癌大鼠造血干細胞抑制率與對肝癌細胞抑制率比較有顯著性差異,t值與P值分別為:t=7.051(P=0.000)；t=9.513(P=0.000)；t=7.239(P=0.000)；t=12.023(P=0.000)與t=10.091(P=0

8、.000)。(2)表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對肝癌細胞抑制率與其作用肝癌細胞后移植瘤重量間進行相關(guān)分析,具體相關(guān)系數(shù)為:表阿霉素r=0.065(P=0.878)；5-氟尿嘧啶,r=0.033(P=0.939)；健擇r=-0.539(P=0.168)；環(huán)磷酰胺r=0.026(P=0.950)；順鉑r=0.600(P=0.116),均無相關(guān)性。而化療藥物對肝癌大鼠造血干細胞抑制率與對應(yīng)藥物作用后肝癌細胞移植瘤重量進

9、行相關(guān)分析,具體相關(guān)系數(shù)為:表阿霉素r=-0.727(P=0.041)；5-氟尿嘧啶,r=-0.927(P=0.001)；健擇r=-0.901(P=0.002)；環(huán)磷酰胺r=-0.774(P=0.024)；順鉑r=-0.783(P=0.022),化療藥物對造血干細胞抑制率與肝癌細胞增殖侵襲能力有負相關(guān)性,并且相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)意義。對阿霉素、順鉑、洛拉曲克的敏感度從高到低依次為HepG2細胞,肝癌細胞,間充質(zhì)細胞。而絲裂霉素藥敏顯示,3種細胞

10、藥物敏感度從高到低依次為HepG2,間充質(zhì)干細胞,肝癌細胞。
　　 結(jié)論:(1)選取的五種臨床常用化療藥物中,其作用機制互不相同。實驗結(jié)果,同一個體的肝癌細胞和造血干細胞對不同的藥物敏感性有差異?；熕幬飳Ω伟┐笫笤煅杉毎种坡市∮趯Ω伟┘毎种坡?腫瘤干細胞可能類似造血干細胞的耐藥機制。(2)化療藥物對肝癌細胞抑制率不能完全反映肝癌細胞增殖侵襲能力?；熕幬飳υ煅杉毎种坡氏鄬τ诟伟┘毎梢暂^好反映腫瘤細.胞增殖侵襲能力。