樺褐孔菌抗突變活性成分inotodiol對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡和抗增殖作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究樺褐孔菌抗突變活性成分inotodiol對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡和抗增殖作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，為開發(fā)高效抗腫瘤新藥提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法：應(yīng)用MTT法測(cè)定樺褐孔菌抗突變活性成分對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用；通過倒置顯微鏡、HE染色光學(xué)顯微鏡、吖碇橙(AO)/溴化乙啶(EB)染色熒光顯微鏡及透射電子顯微鏡技術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用生物化學(xué)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞

2、凋亡定量分析和細(xì)胞周期的變化；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)藥物處理前后增殖細(xì)胞核抗原Ki-67及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p53、Fas及FasL的基因蛋白表達(dá)。 結(jié)果： MTT法檢測(cè)結(jié)果，20，40，80mg/L樺褐孔菌抗突變活性成分在體外對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株有明顯的抑制生長(zhǎng)的作用，且呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴性。倒置顯微鏡觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞體積變小、變圓，核染色質(zhì)凝集，細(xì)胞間連接

3、疏松，貼壁能力減弱： HE染色觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞體積變小、變圓，核染色質(zhì)濃縮或染色質(zhì)塊形成，有的細(xì)胞膜起泡形成凋亡小體；AO/EB熒光染色觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色，胞質(zhì)內(nèi)的橘紅色或橘黃色熒光消失，細(xì)胞周圍呈亮綠色的凋亡小體；透射電鏡觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、邊集，胞質(zhì)內(nèi)可見有空泡，也可見凋亡小體凸出于細(xì)胞表面。生物化學(xué)TUNEL染色法檢測(cè)結(jié)果，藥物在20mg/L時(shí)就能誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞株凋亡，腫瘤細(xì)胞

4、凋亡率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，顯示明顯的時(shí)效關(guān)系，當(dāng)藥物作用48h其AI達(dá)高峰：免疫細(xì)胞化學(xué)ki-67抗原檢測(cè)結(jié)果，ki-67陽性表達(dá)率隨藥物濃度的提高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴性關(guān)系；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組凋亡率明顯增加，當(dāng)20μg/ml樺褐孔菌抗突變活性成分處理24、48h時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡峰，凋亡率分別為18.41％、36.12％，不同作用時(shí)間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，G<,0>/G<,1>期

5、和G<,2>/M期細(xì)胞百分比下降，而S期細(xì)胞百分比上升，表明腫瘤細(xì)胞在S期聚積，阻滯了向G<,2>/G<,0>期的轉(zhuǎn)換，從而影響細(xì)胞周期：凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組Bcl-2基因蛋白陽性表達(dá)率明顯降低，而Bax、Caspase-9、Caspase-3、p53、Fas及FasL基因蛋白陽性表達(dá)率明顯升高。 結(jié)論： 1)樺褐孔菌抗突變活性成分在體外對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株有抑制增殖作用，呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。

6、2)經(jīng)凋亡形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及流式細(xì)胞儀結(jié)果分析，樺褐孔菌抗突變活性成分作用于人肺癌A549細(xì)胞株后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 3)樺褐孔菌抗突變活性成分通過干擾細(xì)胞周期抑制人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要阻滯細(xì)胞周期的S期。 4)樺褐孔菌抗突變活性成分可能是通過下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax基因蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，與啟動(dòng)Caspase-9、Caspase-3的凋亡信號(hào)有關(guān)，并通過細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑來完成凋