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文檔簡介
1、研究背景: 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種難治性,致死性疾病,社會危害極大。狼瘡鼠模型的建立極其重要,但既往各種鼠模型建立的方法均存在缺點,肽誘導(dǎo)鼠模型因其特異性強而引起關(guān)注,但多缺乏空間構(gòu)象。我們擬采用噬菌體隨機12肽庫篩選的特異Sm抗原模擬表位特異性強,且具有構(gòu)像型表位信息,可以模擬正常情況下sLE患者體內(nèi)的抗原抗體反應(yīng),國內(nèi)外均無類似研究。 而且目前治療SLE的藥物為糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺等,這些藥物的副作用大且嚴(yán)重
2、,尋找SLE新的治療途徑極其重要。C反應(yīng)蛋白(CRP)為人正常血清蛋白成分,不具有毒性及免疫抑制作用,國外有研究認(rèn)為其可以用于治療SLE,但結(jié)果及結(jié)論不一,國內(nèi)尚無此類研究。本課題研究Sm抗原在發(fā)病中的作用,并觀察c反應(yīng)蛋白對狼瘡樣綜合征的干預(yù)效果。 第一章:Sm抗原模擬位的篩選與鑒定 目的:為尋找Sm抗原模擬位,利用噬菌體肽庫技術(shù)進(jìn)行篩選。 方法:用鼠Sm單克隆抗體對噬菌體隨機12肽庫進(jìn)行三輪親和篩選,用Dot
3、-ELISA法和雙抗體夾心EIJSA法鑒定隨機挑選的5個噬菌體克隆并測序。 結(jié)果:經(jīng)三輪親和篩選后,特異性噬菌體得到了有效富集;5個隨機挑選的噬菌體克隆均為陽性;測序得到5個不同序列,氨基酸序列IR、SQ、PP出現(xiàn)頻率升高。 結(jié)論:利用鼠單克隆Sm抗體篩選噬菌體隨機12肽庫,成功篩選出Sm抗原模擬表位。 第二章:狼瘡樣鼠模型構(gòu)建的研究 目的:為測定噬菌體肽庫技術(shù)篩選的Sm抗原模擬表位的免疫原性,將其免疫正
4、常BALB/c小鼠,觀察建模效果。 方法:5個陽性噬菌體克隆混合免疫正常BALB/c小鼠。分別于第O天,14天,28天,42天,實驗?zāi)P徒M在背部皮下注射陽性噬菌體克隆(O.1m1/只);噬菌體對照組和空白對照組分別于背部皮下注射O.1ml原始噬菌體和PBS液。采集第O天,14天,28天,42天和56天注射前小鼠血清;自0天至第56天每3天留尿查一次尿蛋白。第56天處死小鼠,取腎臟行常規(guī)病理活檢及直接免疫熒光法檢測腎臟IgG型免疫
5、復(fù)合物沉積。ELISA法檢測血清抗dsDNA抗體和抗核抗體(ANA),免疫印跡法測定可溶性核抗原(ENA)自身抗體譜。 結(jié)果:實驗?zāi)P徒M小鼠自第14天出現(xiàn)抗dsDNA抗體,自第28天出現(xiàn)抗核抗體(ANA),且水平持續(xù)升高,小鼠均出現(xiàn)抗Sm抗體,部分小鼠還出現(xiàn)抗SSA、SSB、rRNP、抗Jo-1等多種自身抗體;出現(xiàn)尿蛋白并持續(xù)加重;第56天實驗?zāi)P徒M小鼠腎臟可以檢測到狼瘡腎炎病理改變及IgG型免疫復(fù)合物沉積。噬菌體對照組與空白對
6、照組均無類似改變。 結(jié)論:將篩選出的Sm抗原模擬表位陽性噬菌體克隆注入非自身免疫BALB/c小鼠體內(nèi)成功誘導(dǎo)出狼瘡樣綜合癥。 第三章:C反應(yīng)蛋白(CRP)干預(yù)狼瘡樣鼠模型形成的研究 目的:為了解CRP對SLE的治療效果及作用機理。 方法:45只正常BALB/c小鼠隨機分為三組:空白對照組、CRP早期干預(yù)組和CRP晚期干預(yù)組??瞻讓φ战M經(jīng)背部皮下注射PBS后按前法造模,CRP早期干預(yù)組經(jīng)背部皮下注射0.2m
7、l CRP一次后按前法造模。CRP晚期干預(yù)組小鼠按前法造模,第21天背部皮下注射CRP0.2ml一次。標(biāo)本收集及檢測同第二章。 結(jié)果:CRP早期干預(yù)組小鼠,抗dsDNA抗體及ANA水平上升趨勢較緩,對應(yīng)OD值均明顯低于空白對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05);CRP晚期干預(yù)組小鼠,抗dsDNA抗體及ANA在第28天(注射CRP后)出現(xiàn)一過性降低,后又呈上升趨勢,與空白對照組相比,差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。三
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