B7-1人-鼠嵌合抗體對小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預效應及分子機制的研究.pdf

1、B7-1（又稱CD80）是主要表達于抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要共刺激分子。B7-1與相應的受體CD28結合，介導的共刺激信號，是T、B細胞活化、增殖、分化進而發(fā)揮免疫效應所必需的。缺乏該信號，T細胞將進入無反應狀態(tài)（Anergy）或免疫耐受（Tolerance），甚至程序性死亡（Apoptosis）。
　　自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是自身反

2、應性T、B淋巴細胞過度活化，導致大量自身抗體生成，進而累及多系統(tǒng)、多器官的一類嚴重疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。B7/CD28信號通路的過度活化與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關，已有文獻報道B7-1和B7-2單克隆抗體可有效減少SLE模型小鼠免疫細胞的活化，自身抗體的生成，逆轉SLE的腎臟病理損傷。
　　嵌合抗體（chimeric antibody）是由鼠源性抗

3、體的可變區(qū)基因與人源性抗體的恒定區(qū)基因拼接而成的嵌合基因，插入載體后轉染至中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)表達的抗體分子。因其減少了鼠源成分，從而降低了人抗鼠抗體反應(human anti-murine-antibody response，HAMA)的發(fā)生，成為了新的研究熱點。
　　本課題在建立和人紅斑狼瘡類似的慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）小鼠狼瘡樣腎炎模型并對其進行生物學鑒定的基礎上，運

4、用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗體對該疾病模型進行干預。通過免疫學、血清學及腎臟組織形態(tài)學等指標動態(tài)評價嵌合抗體對疾病模型的免疫干預效應，同時為該類疾病尋找新的高效、特異、低毒的免疫干預手段。
　　一、B7-1人-鼠嵌合抗體的制備及鑒定
　　目的：制備B7-1人-鼠嵌合抗體并對其生物學特性進行鑒定。
　　方法：采用細胞大規(guī)模培養(yǎng)法制備嵌合抗體；Protein G免疫親和層析法分離純化抗體；流式細胞術分析嵌合抗體對人及小

5、鼠細胞膜型B7-1分子抗原表位的識別。
　　結果：經Protein G親和層析柱分離純化，細胞培養(yǎng)上清中嵌合抗體蛋白的得率約為25mg/L；B7-1嵌合抗體與L929-B7-1、Daudi以及小鼠脾臟細胞的陽性結合率分別為94.2％、93.8%及65.4%。
　　結論：本研究所用B7-1人-鼠嵌合抗體既能識別人的B7-1分子抗原表位又能識別鼠的B7-1分子抗原表位。
　　二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及

6、生物學鑒定
　　目的：構建cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型，并通過免疫學、血清學和組織形態(tài)學對其進行生物學鑒定。
　　方法：將30只6~8周齡雌性( C57BL/6×BALB/ c)BCF1小鼠隨機分為2組，模型組于0、3、7和11d經眼眶靜脈注射親代BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞107/100μL/只。對照組給予等體積生理鹽水。末次注射后第7天，雙色免疫熒光及流式細胞術分析小鼠脾臟淋巴細胞活化情況；每2周定期檢測小鼠血清中抗ds

7、DNA抗體及ANA含量；每4周試紙法定期檢測尿蛋白含量。實驗的第12周處死所有小鼠，取腎臟HE染色觀察腎臟組織病理改變，直接免疫熒光法檢測免疫復合物（IC）的沉積情況及透射電鏡法觀察腎小球超微結構的改變。
　　結果：模型組小鼠脾臟細胞抗原遞呈細胞（MHCⅡ+細胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例較對照組明顯上升（P<0.05），抗體形成細胞（B220+）上B細胞表面活化標志CD21和CD23及共刺激分子CD80和CD

8、86的表達明顯上升（P<0.05），同時T細胞表面活化標志CD4、CD8a、CD25、CD28和CD152表達也明顯上升（P<0.05）；12周時，100%的模型組小鼠出現蛋白尿；4周時，血清中抗dsDNA抗體和ANA陽性率分別為50%和90%；HE染色鏡下觀察,模型組腎小球腫脹，有淋巴細胞浸潤及新月體生成；直接免疫熒光法可見腎小球血管襻有大量IC沉積；透射電鏡下可見模型組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚，大量電子致密物沉積。
　　結論：本

9、研究成功建立可靠的cGVHD小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三、B7-1人-鼠嵌合抗體對小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預效應及分子機制的研究
　　目的：運用B7-1人-鼠嵌合抗體對狼瘡樣腎炎模型小鼠的進行免疫干預效應并探討其分子機制。
　　方法：按第二部分建模方法建模，取BCF1代小鼠隨機分為抗體干預組、CTX干預組和模型組?？贵w干預組在末次注射淋巴細胞后第1、3、5、8、15、30及60d分別經眼眶靜脈注射B7-1嵌合抗體(克隆號

10、2B11)200μg/100μL/只，CTX干預組在末次注射淋巴細胞后第1、3、5、8、15天分別腹腔注射CTX2.5mg/100μL/只。按照上述時間點取材分析小鼠脾臟淋巴細胞活化情況，抗dsDNA抗體、ANA及尿蛋白含量，觀察腎臟組織HE染色，免疫復合物（IC）沉積，腎小球超微結構改變等情況。
　　結果：流式細胞術結果顯示，抗體干預組小鼠脾臟抗原遞呈細胞（MHCⅡ+細胞）膜型CD11b+，CD11c+和Gr1+的比例較模型組明

11、顯降低（P<0.05），抗體形成細胞（B220+）上B細胞表面活化標志CD21和CD23以及共刺激分子CD80和CD86的表達明顯降低（P<0.05），同時T細胞表面活化標志CD25、CD28和CD152表達也明顯降低（P<0.05）；12周時，模型組小鼠血清抗dsDNA抗體陽性率為50%，而抗體干預組未檢出，模型組ANA的陽性率為90%，抗體干預組為40%，且熒光面積和熒光亮度均下降；12周時，模型組100%的小鼠出現蛋白尿，尿蛋白含

12、量為（++~++++），而抗體干預組12周時僅有30%的小鼠出現蛋白尿，尿蛋白含量為（+~++）；HE染色鏡下觀察,模型組腎小球腫脹，有淋巴細胞浸潤及新月體生成，而抗體干預組僅有部分出現腎小球體積輕度增大，腎小球囊腔厚薄略微不均一，有少量炎性細胞浸潤；直接免疫熒光法可見模型組腎小球血管襻有大量IC沉積，抗體干預組的腎小球部位也可見少量熒光，熒光面積和熒光亮度都弱于模型組；透射電鏡下可見模型組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚，大量電子致密物沉積，而