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文檔簡介
1、B7-1是表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要協(xié)同刺激分子,其相應(yīng)的受體是表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD28家族分子。B7-1與CD28結(jié)合是介導(dǎo) T細(xì)胞活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的協(xié)同刺激信號。若缺乏該信號,T細(xì)胞將進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)(Anergy)或免疫耐受(Tolerance)甚至引起程序性死亡(Apoptosis)。
自身免疫性疾?。╝utoimmune disease
2、,AID)是自身反應(yīng)T、B細(xì)胞過度活化,產(chǎn)生大量自身抗體,進(jìn)而導(dǎo)致多系統(tǒng)、多器官受損的一類嚴(yán)重疾病。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是其典型代表。目前研究發(fā)現(xiàn),B7-CD28協(xié)同刺激信號參與了SLE的發(fā)生發(fā)展,阻斷或削弱該信號,可減輕此類疾患的病理損傷。通過建立動物疾病模型模擬人類疾病的發(fā)生過程及臨床表現(xiàn)是研究疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及尋找新的診治途徑的重要手段。本課題在建立慢性移植物抗宿主
3、?。╟GVHD)小鼠狼瘡樣腎炎模型并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,運用自行研制的B7-1單克隆抗體對疾病模型進(jìn)行干預(yù)。通過免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟病理損傷評價等指標(biāo)考察抗體對疾病模型的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及分子機制。以期尋找新的對SLE及相關(guān)疾患具有防治作用的特異、高效、低毒的生物制劑。
一、B7-1單克隆抗體的制備及鑒定
目的:制備鼠抗人B7-1單克隆抗體并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法:采用體內(nèi)誘生腹水法制備單抗;Protein G
4、免疫親和層析法純化抗體;流式細(xì)胞術(shù)分析單抗對人及小鼠細(xì)胞膜型B7-1分子抗原表位的識別。結(jié)果:經(jīng)體內(nèi)誘生腹水法制備單抗,小鼠腹水形成陽性率約為80%,腹水收獲量平均為3.5ml/只小鼠;經(jīng)免疫親和層析法純化,腹水中抗體蛋白的得率為3.2mg/ml;B7-1單克隆抗體與轉(zhuǎn)人B7-1基因小鼠成纖維細(xì)胞株L929-B7-1以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為99.3%及65.4%。結(jié)論:B7-1單克隆抗體能夠特異性識別相應(yīng)的抗原分子。
5、 二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定
目的:構(gòu)建慢性移植物抗宿主病(cGVHD)小鼠狼瘡樣腎炎模型并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法:將8周齡雌性(C57BL/6×BALB/c) F1小鼠隨機分為2組,造模組于0、3、7和11 d經(jīng)尾靜脈注射親代雌性BALB/ c小鼠脾臟細(xì)胞107/100μL/只。正常對照組給予等量生理鹽水。末次注射后第7天,免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞(CD11b+)、樹突狀細(xì)
6、胞(CD11c+)、中性粒細(xì)胞(Gr1+)及抗體產(chǎn)生細(xì)胞(CD21+等)的陽性百分率;每2周定期檢測血清中抗雙鏈 DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體( ANA)含量;每月定期檢測尿蛋白含量。3個月后處死小鼠,經(jīng) HE染色觀測腎臟病理變化,石蠟切片直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物(IC)的沉積以及透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:造模組小鼠脾臟中CD11b+、CD11c+及Gr1+細(xì)胞的百分率較對照組明顯升高(p<0.05),同時 B
7、細(xì)胞協(xié)同刺激分子 CD21+、CD23+、CD80+及 CD86+的表達(dá)上調(diào)明顯(p<0.05);建模2周,70%的小鼠血清中可檢測到抗dsDNA抗體和ANA,4周時達(dá)90%;建模3個月,70%的小鼠出現(xiàn)蛋白尿,蛋白含量為++~++++;HE染色及鏡下觀察,出現(xiàn)腎小球腫脹及淋巴細(xì)胞浸潤;直接免疫熒光法呈現(xiàn)大量IC沉積;透射電鏡下可見造模組小鼠腎基底膜節(jié)段性增厚等病理改變。結(jié)論:成功建立慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎炎模型。
三
8、、B7-1單克隆抗體對小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制研究
目的:探討B(tài)7-1單克隆抗體通過阻斷B7-1/CD28信號通路對狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機制。方法:按上述建模方法,取F1代小鼠隨機分為3組,即造模組、抗體干預(yù)組及對照組。每組15只。干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后第1、3、5、8及15d分別尾靜脈注射B7-1抗體(克隆4E5)200μg/只,然后每月再注射1次,連續(xù)注射2次。造模組同一時間給予等劑量的I
9、g同型對照。按照上述時間點分析脾臟中巨噬細(xì)胞(CD11b+)、樹突狀細(xì)胞(CD11c+)、中性粒細(xì)胞(Gr1+)及抗體產(chǎn)生細(xì)胞(CD21+等)的陽性百分率,抗雙鏈DNA抗體(ds-DNA)、抗核抗體( ANA)含量,尿蛋白含量,免疫復(fù)合物(IC),腎小球超微結(jié)構(gòu)等指標(biāo)。結(jié)果:免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,抗體干預(yù)組小鼠脾臟細(xì)胞CD11b+、CD11c+及GR1+等分子的表達(dá)及脾臟B細(xì)胞CD21+、CD23+、CD80+及CD86+等
10、分子的表達(dá)均低于造模組(p<0.05);4周后,造模組90%的小鼠血清能檢測到抗dsDNA抗體和ANA的表達(dá),而抗體干預(yù)組僅40%出現(xiàn)陽性,且抗體滴度明顯低于造模組(p<0.05);3個月時70%的造模組小鼠出現(xiàn)蛋白尿,蛋白含量為++~++++,抗體干預(yù)組僅有20%,且蛋白含量為+~++; HE染色后鏡下觀察,造模組腎臟組織出現(xiàn)腎小球腫脹,淋巴細(xì)胞浸潤等典型的炎性改變,但抗體干預(yù)組僅部分出現(xiàn)腎小球體積輕度增大,少許淋巴細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管
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