B7-2單克隆抗體對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種由自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞異常活化后產(chǎn)生自身抗體為特征的疾病。病變可累及全身,造成關(guān)節(jié)、皮膚、腎臟、心臟、肺、血管等各臟器和組織不可逆的慢性破壞和功能喪失。其中狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是SLE最常見也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。該病的病因至今尚無明確定論,可能與遺傳及環(huán)境等多種因素有關(guān)。B7-2分子屬于免疫球蛋白超

2、家族成員之一,是抗原遞呈細(xì)胞(antigen present-ing cell, APC)表面重要的協(xié)同刺激分子。其與表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合,介導(dǎo) T細(xì)胞活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應(yīng)。缺乏該信號,T細(xì)胞將進入無反應(yīng)狀態(tài)(Anergy)或免疫耐受(Tolerance)甚至引起程序性細(xì)胞死亡(Apoptosis)。研究發(fā)現(xiàn),B7-CD28協(xié)同刺激信號參與了SLE的發(fā)生發(fā)展,并發(fā)揮著重要的作用。B7分子的特異性抗體可阻斷或削弱B7-

3、CD28信號,從而抑制免疫應(yīng)答,因此通過應(yīng)用B7-2抗體阻斷或削弱B7-CD28通路有望為SLE提供新的生物治療方法。本課題通過建立與人類SLE疾病相似的慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼瘡樣腎炎小鼠模型。運用自行研制的B7-2單克隆抗體對疾病模型進行干預(yù),從免疫學(xué),血清學(xué),腎臟組織形態(tài)學(xué)等方面的指標(biāo)來考察抗體對疾病模型的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及可能的分子機制。本研究分為三個部分：
　　第一部分：B7-2單克隆抗體的制備及鑒定。
　　目的

4、：制備B7-2單克隆抗體并對其進行生物學(xué)特性鑒定。
　　方法：應(yīng)用本科室成功建立的穩(wěn)定分泌B7-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1D1,采用體內(nèi)誘生腹水法制備單抗;Protein G免疫親和層析法純化抗體;流式細(xì)胞術(shù)分析單抗對不同細(xì)胞膜型 B7-2分子的識別。
　　結(jié)果：經(jīng)體內(nèi)誘生腹水法制備 B7-2單抗,小鼠腹水形成陽性率約為80％,腹水收獲量平均為3ml/只小鼠;經(jīng)免疫親和層析法純化,腹水中抗體蛋白的得率為3mg/ml;單抗與

5、轉(zhuǎn)人B7-2基因小鼠成纖維細(xì)胞株L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為99.3％、96.7％及61.2％。
　　結(jié)論：B7-2單克隆抗體能夠特異性識別不同細(xì)胞膜型B7-2分子。
　　第二部分：慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型的建立及病理性鑒定。
　　目的：對慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型進行免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟病理損傷鑒定。以考察該模型作為SLE疾病模型的可靠性。
　　方法：將

6、親代雌性BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞懸液經(jīng)尾靜脈注射(C57BL/J6×BALB/c) F1代小鼠,每隔3天注射1次,共4次。建模后1周,采用免疫熒光及流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟中抗原提呈細(xì)胞(APC)及抗體形成細(xì)胞的百分率。每隔2周檢測血清中anti-dsDNA抗體及ANA;每隔4周檢測尿蛋白量的動態(tài)變化;建模12周終止實驗,取腎臟組織作HE染色觀察病理改變,直接免疫熒光法檢測免疫復(fù)合物(IC)沉積以及透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)變化。

7、　　結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果顯示,造模后1周脾臟中膜型CD11b+、CD11c+及GR1+細(xì)胞的百分率較對照組明顯升高(P<0.05),同時抗體形成細(xì)胞 B220+表面 CD21、CD23、 CD80及 CD86分子的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05);建模2周時,血清anti-dsDNA抗體出現(xiàn)陽性,4周時ANA出現(xiàn)陽性;12周時80％的小鼠存在蛋白尿,蛋白含量++~++++;腎小球體積增大并有大量炎性細(xì)胞浸潤;腎臟IC沉積;透射電鏡下可見

8、腎基底膜節(jié)段性增厚,臟層上皮細(xì)胞和基底膜之間存在大量的電子致密物。
　　結(jié)論：慢性移植物抗宿主病狼瘡樣腎炎小鼠模型具有人類SLE相似的免疫細(xì)胞異常活化及腎臟病理損傷的特征性表現(xiàn),用于相關(guān)研究具有可靠性。
　　第三部分：B7-2單克隆抗體對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制的研究。
　　目的：探討B(tài)7-2單克隆抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號通路對狼瘡樣腎炎小鼠模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及可能的分子機制。
　　

9、方法：按第二部分的建模方法,取雌性BCF1代小鼠隨機分為3組,模型組、抗體干預(yù)組及對照組,每組15只。干預(yù)組在末次注射淋巴細(xì)胞后的第1、3、5、8及15d分別尾靜脈注射B7-2單抗(克隆1D1)8mg/kg,然后每月再注射1次,連續(xù)注射2次。模型組同一時間給予等劑量的小鼠Ig同型對照。分析脾臟中巨噬細(xì)胞(CD11b+)、樹突狀細(xì)胞(CD11c+)、中性粒細(xì)胞(Gr1+)的百分率及抗體形成細(xì)胞B220+細(xì)胞表面CD21、CD23、CD80

10、及CD86分子的表達(dá)量,anti-dsDNA抗體、ANA含量,尿蛋白含量,免疫復(fù)合物,腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)改變等指標(biāo)。
　　結(jié)果：免疫熒光分析干預(yù)組小鼠CD11b+、CD11c+及GR1+細(xì)胞的百分率上調(diào)程度均低于模型組(p<0.05);同時干預(yù)組B220+細(xì)胞表面CD21、CD23、CD80及CD86分子表達(dá)上調(diào)程度均低于模型組(p<0.05),提示B7-2單抗可以阻斷或削弱B7/CD28信號通路,從而抑制機體的免疫應(yīng)答;模

11、型組90％的小鼠血清能檢測到anti-dsDNA抗體和ANA的表達(dá),干預(yù)組僅有40％,且干預(yù)組的血清抗體滴度明顯低于模型組;12周時80％的模型組小鼠存在蛋白尿,蛋白含量++~++++,20％的干預(yù)組小鼠存在蛋白尿,蛋白含量為+~++;模型組腎臟組織切片HE染色顯示腎臟出現(xiàn)腎小球腫脹,淋巴細(xì)胞浸潤等典型的炎性改變,干預(yù)組腎小球體積輕度增大,少許淋巴細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管腔及球囊腔體積基本正常,兩組相比較,干預(yù)組腎臟病理學(xué)改變輕于模型組;熒光

12、顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)模型組腎小球 IC沉積,與模型組相比,干預(yù)組沉積在腎小球上的IC少于模型組;透射電鏡超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)模型組基底膜節(jié)段性增厚,內(nèi)皮下大量電子致密物沉積等病理改變,與模型組相比,干預(yù)組基底膜厚度均勻,病理改變較輕。
　　結(jié)論：B7-2單克隆抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號可降低免疫細(xì)胞的異?；罨?減少自身抗體的產(chǎn)生從而減輕免疫復(fù)合物對腎功能的損傷。因此B7-2單克隆抗體的免疫干預(yù)可逆轉(zhuǎn)狼瘡樣腎炎小鼠的病理損傷,提示其