基于抑制狼瘡小鼠B淋巴細(xì)胞分化的Blimp-1 SiRNA防治狼瘡腎炎的機(jī)制研究.pdf

1、SLE患者由于免疫耐受的異常和B淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中存在輕重不一的缺陷，表現(xiàn)為身體內(nèi)明顯增多的對自身組織反應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，從而會生成以抗核抗體和雙鏈DNA抗體為代表的多種多樣的自身抗體，隨時間發(fā)展越來越多的免疫復(fù)合物沉積最后臨床出現(xiàn)結(jié)締組織病[1-3]。同時B淋巴細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間也存在各種異常:1.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常如細(xì)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化及激酶水平升高，涉及細(xì)胞分化、存活、遷移和細(xì)胞周期異常等。2.B細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子失調(diào)如B淋巴細(xì)胞刺激因子(B-

2、lymphocyte stimulator，BLyS)活性明顯增加遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常[4，5]。3.B細(xì)胞相關(guān)亞群異常如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞功能缺陷。針對自身的B淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)被多種因素增強(qiáng)。
　　作為鋅指蛋白家族成員之一的B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1)是由Turner于1994年報道[6，7]。作為DNA結(jié)合蛋白的Blimp-1由PR區(qū)鋅指蛋白

3、1(PRDM1)基因編碼，主要功能是抑制轉(zhuǎn)錄。其中B淋巴細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子是被抑制的重要對象，它決定B細(xì)胞終末分化，促進(jìn)B細(xì)胞分化為能夠分泌免疫球蛋白的漿細(xì)胞，并影響它的存活。Blimp-1表達(dá)異常會導(dǎo)致自身免疫功能失調(diào)，誘發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫相關(guān)疾病[8，9]。
　　研究認(rèn)為Blimp-1促進(jìn)B細(xì)胞分化主要通過調(diào)節(jié)三類因子表達(dá):1.Blimp-1下調(diào)c-Myc、E2F1抑制B細(xì)胞分裂和增殖;2.Blimp-1促進(jìn)J鏈、XBP

4、-1表達(dá)及Ig重鏈和輕鏈重排，增強(qiáng)抗體分泌;3.Blimp-1下調(diào)生發(fā)中心B細(xì)胞Pax-5、bcl-6表達(dá)。Blimp-1表達(dá)而發(fā)揮促B淋巴細(xì)胞分化作用需要抑制因子Bcl-6、Pax-5、MITF和誘導(dǎo)因子XBP-1、IRF4、AP-1、NF-KB、STAT3之間平衡[10,11]。
　　Blimp-1基因是狼瘡性腎炎的一個易感基因，其可能在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。GaraudJC[12]等研究發(fā)現(xiàn)紅斑狼瘡患者外周血

5、B細(xì)胞Blimp-1mRNAs呈高表達(dá)。PanchanathanR[13]實(shí)驗(yàn)中Blimp-1基因表達(dá)缺失雌性小鼠產(chǎn)生高滴度的狼瘡樣自身抗體。國內(nèi)牛曉昶[14]研究狼瘡病人Blimp-1蛋白高表達(dá)，成熟漿細(xì)胞數(shù)明顯增加?？傊壳皩?shí)驗(yàn)證據(jù)表明Blimp-1與包括紅斑狼瘡在內(nèi)的多種自身免疫性疾病有密切關(guān)聯(lián)。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象[15]是把體外與自身mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA通過各種基因轉(zhuǎn)移手

6、段導(dǎo)入細(xì)胞，導(dǎo)致與自身序列互補(bǔ)相同的mRNA降解。產(chǎn)生結(jié)果是阻止了相關(guān)mRNA翻譯，也就是關(guān)于此mRNA的基因不再表達(dá)而變?yōu)槌聊?，即通常說的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。1990年約根森(Jorgensen)[16]研究小組在研究查爾酮合成酶對花青素合成速度的影響時發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象。之后這種現(xiàn)象逐漸被驗(yàn)證并于1998年由AndrewZ.Fire[17]等詳細(xì)闡述。目前，以核酸為基礎(chǔ)RNAi技術(shù)在癌癥和自身免疫相關(guān)疾病治療中開始展現(xiàn)良好前景。

7、r>　　成熟漿細(xì)胞產(chǎn)生的多種自身抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者病情中起決定性作用[3]。Blimp-1決定B淋巴細(xì)胞終末分化和多種自身反應(yīng)性抗體分泌，Blimp-1異常與紅斑狼瘡的發(fā)生密切相關(guān)[14]?；谝陨媳尘盀榱颂接態(tài)limp-1在狼瘡發(fā)展中的潛在作用，我們構(gòu)建了編碼Blimp-1SiRNA的腺病毒載體。探討B(tài)limp-1SiRNA對Blimp-1表達(dá)及CD138+B細(xì)胞比例影響，進(jìn)而觀察B淋巴細(xì)胞分化情況。另外從SLE臨床角度研究了B

8、limp-1SiRNA對系統(tǒng)性紅斑狼瘡病情作用，包括（抗雙鏈DNA抗體、尿蛋白、腎功能、血清白蛋白等）。
　　方法:基因庫獲得Blimp-1互補(bǔ)DNA，合成Blimp-1SiRNA序列。擴(kuò)增鑒定后與表達(dá)質(zhì)粒PDC315載體連接，獲得陽性克隆質(zhì)粒命名為PDC315-RNAi。Adeno-XTM載體系統(tǒng)與PDC315-RNAi及骨架質(zhì)粒pBHGloXE1.3Cre經(jīng)酶切后重組，獲得陽性克隆質(zhì)粒命名為pAd-Blimp-1/siRNA[

9、18-20]。Lipofectamine2000試劑將pAd-Blimp-1/siRNA載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，3次感染得第四代重組腺病毒pAd-Blimp-1/siRNA。同法獲得第四代重組腺病毒pAd-siRNA/LacZ作為陰性對照。12周BWF1小鼠尾靜脈注射pAd-siRNA/Blimp-1（1*109空斑形成單位）。對照組分別注射pAd-siRNA/LacZ（1*109空斑形成單位）和PBS溶液100ul。每三周處死小鼠用流式細(xì)

10、胞儀分析CD138+細(xì)胞比率。對腺病毒注射21天小鼠分別應(yīng)用RT-PCR檢測Blimp-1mRNA表達(dá)和Western-Blot檢測Blimp-1蛋白、XBP-1蛋白、BCMA蛋白及C-myc蛋白表達(dá)。每三周對小鼠酶聯(lián)免疫分析抗雙鏈DNA抗體滴度(u/ml)，自動生化儀檢測尿素氮、肌酐、血清白蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定尿蛋白含量[21，22]，同時觀察各組小鼠生存期，腺病毒注射18周時分別觀察各組小鼠腎組織病理變化。
　　結(jié)果:

11、>　　1.構(gòu)建了編碼Blimp-1SiRNA重組腺病毒載體。
　　2.對照組12周后CD138+B細(xì)胞比例開始上升，24周達(dá)到高峰8.51±3.08％。而Ad-siRNA/Blimp-1組一直保持相對穩(wěn)定(p＜0.05)。
　　3.Ad-siRNA/Blimp-1組RT-PCR示脾臟B細(xì)胞Blimp-1mRNA表達(dá)抑制率68％，Blimp-170.6％、XBP-1、BCMA蛋白表達(dá)下降，C-Myc蛋白表達(dá)上升，與對照組比較p

12、＜0.05。
　　4.Ad-siRNA/Blimp-1組抗雙鏈DNA抗體滴度維持在基線，對照組抗體水平從200-3000u/ml逐步上升(p＜0.05)，15周后白蛋白下降緩慢。
　　5.模型鼠自第3周開始出現(xiàn)尿蛋白升高，Ad-SiRNA/Blimp-1干擾組從12周尿蛋白排泄明顯減少，較對照組明顯下降（p＜0.05），Ad-SiRNA/LacZ組與PBS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義p＞0.05（12周p＜0.05）。
　　

13、6.各組模型小鼠血清肌酐24周觀察期呈現(xiàn)升高趨勢，12周前三組腎功能均正常，變化不明顯，組間無統(tǒng)計學(xué)差異p＞0.05。15周對照組血清肌酐開始明顯升高，之后9周發(fā)展較快。與對照組比較p＜0.01。
　　7.Ad-siRNA/Blimp-1組小鼠15周無死亡，對照組15周（造模6月）開始死亡，PBS組2只，Ad-SiRNA/LacZ3只，直至24周（造模9月）時對照組小鼠死亡PBS組7只，Ad-SiRNA/LacZ死亡8只，Ad-s

14、iRNA/Blimp-1組存活8只，以存活比例和尾靜脈注射后死亡時間作Kaplan-meier生存曲線，對照組小鼠生存期明顯縮短，經(jīng)Logrank檢驗(yàn)Ad-siRNA/Blimp-1組和對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，Log值6.80，P=0.03，(p＜0.05).三組半數(shù)生存期分別為:＞24W(Ad-siRNA/Blimp-1組)，21W(Ad-SiRNA/LacZ),23W(PBS組)。
　　8.Ad-siRNA/Blimp-1組腎

15、小球體積輕度增大，僅有輕度系膜細(xì)胞基質(zhì)增生，小球炎癥細(xì)胞浸潤輕，無間質(zhì)纖維化，血管壁輕度增厚，小管周圍炎癥細(xì)胞輕度增生。模型對照組腎小球體積增大，彌漫性增生，系膜基質(zhì)增加，炎癥細(xì)胞侵潤重，PBS組小球節(jié)段結(jié)構(gòu)不清，血管壁結(jié)構(gòu)破壞。腎小球和小管損傷計分與Ad-siRNA/Blimp-i組比較p＜0.05。
　　結(jié)論:
　　1.Blimp-1SiRNA解除了對C-myc途徑抑制，使其上調(diào)表達(dá)，下調(diào)了B淋巴細(xì)胞Blimp-1、XB