?；撬釋毙匀毖跽T導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷防護效應(yīng)及機制研究.pdf

1、高原是指海拔超過3000米的地區(qū)，在這樣的高度，大氣壓和氧分壓低，即環(huán)境性缺氧，對進駐高原的人可造成供氧不足，為了適應(yīng)此缺氧環(huán)境，人體器官的生理功能會發(fā)生改變。急進高原時有80％～90％的人會出現(xiàn)不同程度的高原反應(yīng)，嚴重情況下甚至誘發(fā)高山病(altitudeillness，AI)。對視覺的影響主要表現(xiàn)在：暗適應(yīng)時間延長，視力下降，色覺減退，甚至出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血，引起高原視網(wǎng)膜病(high-altituderetinopathy，HAR)。

2、HAR最初表現(xiàn)為血管擴張、出血，嚴重的導(dǎo)致視功能障礙、失明，有的在回到平原后仍不能恢復(fù)正常。 視網(wǎng)膜外層由毛細血管供氧，內(nèi)層的氧供給需要Müller細胞參與。Müller細胞是視網(wǎng)膜中主要的膠質(zhì)細胞，其胞核位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層(innernuclearlayer，INL)，突起則自外界膜縱向伸展，穿過整個視網(wǎng)膜至內(nèi)界膜，在內(nèi)外界膜處構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障。因此，Müller細胞在視網(wǎng)膜物質(zhì)、能量供給和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中擔(dān)任重要角色。缺氧可導(dǎo)致

3、Müller細胞功能全面下降，引起內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)。一方面，缺氧可引起視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元興奮毒性增強，興奮性谷氨酸的持續(xù)作用影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞特別是節(jié)細胞功能，最終觸發(fā)節(jié)細胞的凋亡或死亡，阻斷視覺信號傳遞。Müller細胞是視網(wǎng)膜谷氨酸濃度的調(diào)節(jié)單元，通過胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，主要是谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1(glutamatetransporter1，GLAST)攝取突觸間過多的谷氨酸，由谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)

4、轉(zhuǎn)變?yōu)闊o興奮性的谷氨酰胺。谷氨酸的轉(zhuǎn)運是電壓及K+依賴性的，谷氨酸攝入細胞的同時K+向胞外轉(zhuǎn)運。缺氧時胞外K+濃度升高，谷氨酸的攝入受到抑制。Müller細胞可通過內(nèi)向整流鉀通道(inwardlyrectifyingK+channel，Kir)Kir4.1清除胞外多余的K+，從而減弱高K+濃度對谷氨酸攝入的抑制。但急性缺氧時Müller細胞的谷氨酸攝取和代謝路徑發(fā)生了怎樣的變化，目前尚缺乏深入研究。另一方面，當刺激到來時，組織具有一定的

5、自我防御能力，促進機體快速建立缺氧適應(yīng)是應(yīng)對缺氧的重要途徑，通過增強缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainduciblefactor1，HIF-1)表達能有效改善缺氧反應(yīng)。HIF-1是缺氧耐受因子，能激活多個基因的轉(zhuǎn)錄，增加供氧、提高代謝，反映出機體對缺氧的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力。存在于視網(wǎng)膜Müller細胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucosetransporter1，GLUT-1)為其下游調(diào)控基因之一。HIF-1是否參與了視網(wǎng)膜缺氧適應(yīng)調(diào)節(jié)目前尚無

6、報道。 ?；撬?2-氨基乙磺酸，taurine，Tau)屬于含硫氨基酸，為人體條件必需氨基酸，不參與蛋白質(zhì)合成，在體內(nèi)游離存在或在一些簡單肽類中存在。?；撬崾且暰W(wǎng)膜中含量最豐富的氨基酸之一，具有抗氧化、膜穩(wěn)定、調(diào)節(jié)滲透壓等多種功能。嬰兒缺乏?；撬釋?dǎo)致視網(wǎng)膜電圖異常，眼底可見視網(wǎng)膜色素上皮出現(xiàn)輕微顆粒。敲除?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白基因的老鼠出現(xiàn)了嚴重的視網(wǎng)膜變性。在應(yīng)激狀態(tài)下?；撬嵩谕挥|間的釋放增加也可能引起視網(wǎng)膜細胞中的牛磺酸缺乏，當視網(wǎng)

7、膜細胞中的?；撬峤档蜁r，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。以往研究發(fā)現(xiàn)?；撬釋π募∪毖蹙哂忻黠@的保護作用。另有研究顯示，?；撬釋μ悄虿∫暰W(wǎng)膜病(diabeticretinopathy，DR)的谷氨酸重攝系統(tǒng)有促進作用。牛磺酸是否也能在高原急性缺氧下通過類似作用防護視網(wǎng)膜損傷，國內(nèi)外尚無研究。 基于以上分析，推測，?；撬峥赡苁且环N理想的視覺缺氧損傷防護劑。本研究體內(nèi)實驗以SD大鼠為研究對象，2.4％?；撬峤?jīng)口攝入進行營養(yǎng)干預(yù)，利用低壓氧艙

8、模擬4500米和5500米高原1～3天急性缺氧條件，體外實驗分別以原代混養(yǎng)視網(wǎng)膜細胞和純化視網(wǎng)膜Müller細胞制備細胞缺氧模型。通過免疫組織化學(xué)、酶組織化學(xué)、氨基酸分析、免疫細胞化學(xué)、流式細胞技術(shù)、激光共聚焦分析技術(shù)、RT-PCR、Westernblotting等實驗技術(shù)方法，首次在體內(nèi)觀察急性持續(xù)性缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能損傷及?；撬岬姆雷o效應(yīng)，并在體外進一步研究缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜Müller功能改變及?；撬岬姆雷o作用，從Mülle

9、r細胞谷氨酸清除路徑和缺氧適應(yīng)路徑兩個方面深入探討牛磺酸對視網(wǎng)膜缺氧損傷防護作用可能的分子機制。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.模擬4500米和5500米高原缺氧主要對視網(wǎng)膜內(nèi)層細胞造成影響。視網(wǎng)膜內(nèi)網(wǎng)狀層(innerplexiformlayer，IPL)、節(jié)細胞層(ganglioncelllayer，GCL)出現(xiàn)腫脹，超微結(jié)構(gòu)顯示，Müller細胞出現(xiàn)線粒體脫嵴、腫脹變性。含2.4％?；撬岬臓I養(yǎng)飼料預(yù)先干預(yù)一周，大鼠視網(wǎng)膜

10、內(nèi)層腫脹程度和超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。Müller細胞在中度缺氧早期向IPL移行，有利于保護內(nèi)層神經(jīng)細胞，?；撬崮艽龠MMüller細胞的移行，增強其保護作用。 2.在原代混養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜細胞中，神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞共生良好，神經(jīng)細胞對缺氧更敏感，缺氧后其存活率下降到8％，在培養(yǎng)介質(zhì)中預(yù)先加入0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬峥墒蛊浯婊盥噬仙?6.2％、73.4％和55.7％，1mmol/L?；撬釋μ岣?/p>

11、存活率效果最顯著。提示?；撬岽龠M體外缺氧培養(yǎng)的神經(jīng)細胞存活。 3.缺氧降低Müller細胞24h增殖活性，牛磺酸促進阻滯于G0/G1期的細胞進入S期和G2/M期。完全缺氧24h后Müller細胞活性全面下降，各劑量?；撬岵荒苣孓D(zhuǎn)這一趨勢。缺氧引起Müller細胞特征蛋白神經(jīng)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)和波形蛋白(Vimentin)mRNA和蛋白表達增強，S-100表達核質(zhì)比降低。

12、體內(nèi)實驗2.4％?；撬岬膭┝?，體外實驗0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬釢舛葴p弱缺氧引起的GFAP和VimentinmRNA和蛋白的強表達。S-100表達核質(zhì)比在0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬崽幚砗笤鰪姟Ｌ崾救毖鯇?dǎo)致的Müller細胞功能改變可被?；撬釡p輕或阻止。 4.琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase，SDH)和乳酸脫氫酶(Lactatedehyd

13、rogenase，LDH)的酶組織化學(xué)染色陽性部位主要在視網(wǎng)膜外網(wǎng)狀層(outerplexiformlayer，OPL)、IPL和GCL，急性缺氧造成SDH、LDH活性在1～3天顯著下降，其下降程度隨模擬高度增加和缺氧時間延長而加劇，?；撬崮苊黠@緩解缺氧引起的SDH、LDH活性下降，但不能使酶活性恢復(fù)到正常水平。表明?；撬崮軌蛲ㄟ^保護細胞線粒體，抑制缺氧引起的有氧代謝酶和無氧代謝酶活性下降，在一定程度上提高視網(wǎng)膜在急性缺氧時的能量代謝。

14、 5.缺氧引起視網(wǎng)膜內(nèi)氨基酸類遞質(zhì)/抑質(zhì)濃度改變。其中興奮性遞質(zhì)谷氨酸、甘氨酸隨缺氧程度加深含量增加，谷氨酸分布于視網(wǎng)膜IPL和GCL，?；撬崦黠@抑制了谷氨酸和甘氨酸的增加。?；撬岽龠M視網(wǎng)膜中GLAST、GS和Kir4.1mRNA的表達，提高了攝取和代謝谷氨酸的能力。Müller細胞缺氧后內(nèi)源性谷氨酸升高，0.1mmol/L、1mmol/L和10mmol/L的?；撬峋蛊浔磉_下降，下降幅度與應(yīng)用劑量相關(guān)。提示缺氧抑制了Mülle

15、r細胞自身谷氨酸代謝，?；撬嵬ㄟ^上調(diào)谷氨酸清除路徑相關(guān)因子增強Müller細胞對谷氨酸的調(diào)節(jié)能力。 6.體內(nèi)外實驗均證實HIF-1參與了視網(wǎng)膜缺氧適應(yīng)。急性缺氧引起視網(wǎng)膜中HIF-1α和HIF-1βmRNA水平上升。HIF-1αmRNA和蛋白在缺氧6h迅速上升到峰值，表達主要出現(xiàn)在內(nèi)核層(innernucleralayer,INL)和GCL的細胞核中，與常氧下相比，模擬5500米缺氧6hINL細胞HIF-1α細胞陽性率從22.2

16、％提高到64.4％，?；撬岽龠MHIF-1αmRNA和蛋白的一過性表達，提高細胞陽性率到92.6％。牛磺酸提高HIF-1βmRNA表達峰值，并將其高峰出現(xiàn)的時間延長到12h，有利于HIF-1在視網(wǎng)膜中的持續(xù)作用，促進缺氧適應(yīng)。GLUT-1mRNA和蛋白在缺氧早期下降，24h后增強。說明?；撬峒ぐl(fā)GLUT-1在缺氧后期的強表達。提示牛磺酸能通過激活HIF-1通路上下游基因促進Müller細胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運能力，促進視網(wǎng)膜的缺氧適應(yīng)。