應(yīng)用支撐向量模型預(yù)測晚期鼻咽癌預(yù)后及在鼻咽癌細胞中靶向Aurora-A激酶的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌(NPC)作為與EB病毒感染密切相關(guān)的頭頸部腫瘤對放射治療敏感，使得放療成為未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者的首選根治性治療手段。雖然近年來放射治療技術(shù)的進步、化療及靶點藥物等綜合治療方法的應(yīng)用，在一定程度上提高了腫瘤的局部控制率，減輕了周圍正常組織的不良放療反應(yīng)，但是患者5年生存率仍然徘徊在60％左右，局部晚期患者甚至更低。本研究分為六個部分：
　　 第一章：25種分子標(biāo)記物在鼻咽癌中的表達檢測及數(shù)據(jù)預(yù)處理。
　　 目的：檢測2

2、5種分子標(biāo)記物在局部晚期鼻咽癌組織中的表達情況，通過半定量評分量化各分子在組織中的表達水平，并對各分子的表達與患者預(yù)后關(guān)系進行初步探討。
　　 方法：通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測了HIF-1α，Aurora-A，Beclin1，EZH2，E-Cadherin，N-Cadherin,CENP-H，cyclin Dl，Stathmin,β-catenin,Survivin，MMP-2，c-Met，Ki-67，P21，CDC2，Bcl

3、-2，COX-2，nm23-H1，Bax，Snail，Twist,ERK，P27及TIMP-2等25種分子標(biāo)記物的表達水平。
　　 結(jié)果：ROC曲線分析結(jié)果顯示：在誘導(dǎo)+放療組患者(IC/RT)，Aurora-A、Beclin1、Bcl-2、MMP-2、CENP-H、Stathmin、N-Cadherin、Bax、P27及TIMP-2對患者治療后5年的生存狀態(tài)(生存VS死亡)具有較高的預(yù)測價值;在誘導(dǎo)+同期放化療組(IC/CRT

4、)患者，Aurora-A、Beclin1、HIF-1α、Bcl-2及c-Met對患者治療后5年的生存狀態(tài)具有較高的預(yù)測價值。
　　 結(jié)論：本部分研究通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)結(jié)合量化評分，并通過ROC曲線及Kaplan-Meier生存分析初步鑒別出Aurora-A、Bcl-2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2及HIF-1α等分子對局部晚期鼻咽癌患者具有較高的生存狀態(tài)預(yù)測能力，這些預(yù)后分子將為隨后SVM模型的建立提供

5、數(shù)模基礎(chǔ)。
　　 第二章：局部晚期鼻咽癌患者5年生存狀態(tài)SVM預(yù)后模型的建立。
　　 目的：設(shè)計SVM個體化預(yù)后預(yù)測模型，并測試其對局部晚期鼻咽癌患者治療后5年生存狀態(tài)的預(yù)測能力。
　　 方法：選取25種分子標(biāo)記物評分均齊全的120例(IC/RT及IC/CRT各60例)患者作為研究對象。將第一章中篩選出來的Aurora-A、Bcl-2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2、HIF-1α、COX2、患者

6、的血清學(xué)指標(biāo)VCA-IgA及EA-IgA等共計10種因子納入SVM模型設(shè)計，并分別針對IC/RT組患者、IC/CRT組患者及所有患者(IC/RT+IC/CRT)設(shè)計了相應(yīng)的SVM預(yù)后預(yù)測模型-SVM1、SVM2及SVM3。
　　 結(jié)果：測試集測試結(jié)果表明：SVM1模型的陽性預(yù)測值為67.6％，陰性預(yù)測值為85.7％，敏感性為81.3％，特異性為87.0％，總準(zhǔn)確率為85.5％。
　　 結(jié)論：基于Aurora-A、Bcl-

7、2、P27、TIMP-2、Beclin1、MMP-2、HIF-1α、VCA-IgA及EA-IgA等分子設(shè)計的SVM預(yù)后預(yù)測模型對IC/RT、IC/CRT及兩組患者的5年生存狀態(tài)具有較高的個體化預(yù)測能力。
　　 第三章：Aurora-A激酶在鼻咽癌中的表達水平及其臨床意義。
　　 目的：明確Aurora-A激酶在鼻咽癌中的表達水平，分析其與患者各臨床指標(biāo)，尤其是與預(yù)后指標(biāo)間的關(guān)系，為隨后基于此的靶向治療提供堅實的理論基礎(chǔ)。

8、
　　 方法：所需腫瘤組織來自于本研究第一部分第一章患者，利用免疫組織化學(xué)染色的方法我們檢測了145例局部晚期鼻咽癌患者組織中Aurora-A激酶的表達水平。同時，應(yīng)用Western Blot及RT-PCR我們檢測了鼻咽癌細胞株，8例患者鼻咽癌及癌旁正常組織中Aurora-A的表達水平。
　　 結(jié)果：組織及細胞水平研究表明，Aurora-A蛋白及mRNA在鼻咽癌組織及細胞水平表達顯著高于正常鼻咽上皮，Aurora-A在I

9、C/RT及IC/CRT患者組織中的高表達與患者較短的總生存時間(OS)、無進展生存時間(PFS)及無轉(zhuǎn)移生存時間(DMFS)顯著相關(guān)，Aurora-A蛋白高表達是局部晚期鼻咽癌患者OS，PFS及DMFS的負性預(yù)后因子。
　　 結(jié)論：Aurora-A蛋白及mRNA在鼻咽癌組織及細胞水平表達顯著高于正常鼻咽上皮，其高表達是局部晚期鼻咽癌患者OS，PFS及DMFS的負性預(yù)后因子。
　　 第四章：靶向Aurora-A抑制鼻咽癌細

10、胞生長并誘導(dǎo)其凋亡機制的研究。
　　 目的：通過應(yīng)用Aurora-A激酶的小分子抑制劑VX-680作用于鼻咽癌CNE-2細胞，檢測VX-680對鼻咽癌細胞生長增殖及凋亡誘導(dǎo)作用，以明確該小分子抑制劑靶向治療鼻咽癌的作用。
　　 方法：將Aurora-A激酶的小分子抑制劑VX-680作用于鼻咽癌CNE-2細胞株觀察其生長抑制情況。首先，通過Western blot及免疫細胞熒光染色的方法檢測磷酸化Aurora-A激酶(Th

11、r288)的表達情況，明確VX-680對Aurora-A激酶活性的抑制作用；利用MTT法檢測VX-680對CNE-2細胞生長增殖的抑制作用；通過流式細胞技術(shù)及Western blot檢測凋亡標(biāo)志蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3的表達情況，探討VX-680對鼻咽癌CNE-2細胞是否具有凋亡誘導(dǎo)作用；最終明確特異性靶向抑制Aurora-A激酶對鼻咽癌的潛在治療價值。
　　 結(jié)果：VX-680對CNE-

12、2細胞的Aurora-A激酶的自身磷酸化抑制作用在較低濃度即可實現(xiàn)(1-2 nM)，而對Aurora-B激酶的天然底物Histone H3的磷酸化抑制作用則需較高濃度(5 nM)，可見VX-680對鼻咽癌細胞的Aurora-A激酶具有選擇性抑制作用。VX-680可劑量依賴性地抑制鼻咽癌CNE-2細胞的生長增殖，究其機制在于VX-680一方面通過抑制Aurora-A使細胞周期阻滯于G2/M期，另一方面VX-680可誘導(dǎo)細胞凋亡。
　

13、　 結(jié)論：VX-680對Aurora-A激酶具有更強烈的選擇性抑制作用。VX-680可通過阻滯細胞周期于G2/M并誘導(dǎo)線粒體途徑的細胞凋亡雙重途徑抑制細胞的生長增殖。因而，VX-680有望成為鼻咽癌未來靶向治療中的新穎選擇。
　　 第五章：Aurora-A激酶促進鼻咽癌細胞遷徙轉(zhuǎn)移機制的研究。
　　 目的：明確Aurora-A激酶在鼻咽癌細胞遷徙轉(zhuǎn)移過程中的重要作用，并闡明其分子機制。
　　 方法：通過基因轉(zhuǎn)染

14、及RNAi技術(shù)，構(gòu)建Aurora-A高表達、突變失活及低表達的CNE-2細胞。應(yīng)用細胞免疫熒光方法檢測細胞遷徙轉(zhuǎn)移關(guān)鍵步驟—上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Methenchymal Transition,EMT)的標(biāo)志性分子(如胞膜E-Cadherin,β-catenin等)在Aurora-A高表達/低表達/突變失活時表達情況;通過Transwell小室檢測Aurora-A高表達/低表達/突變失活時，鼻咽癌細胞的體外遷徙轉(zhuǎn)移能力的改

15、變情況。
　　 結(jié)果：體外細胞水平研究表明：Aurora-A通過MAPK1/2信號途徑實現(xiàn)其對鼻咽癌細胞EMT、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。Western blot檢測顯示MAPK1/2的表達水平與Aurora-A的表達水平呈正向相關(guān)，抑制MAPK1/2或Aurora-A可獲得相似的細胞表型，如：EMT逆轉(zhuǎn)、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移能力下降等。
　　 結(jié)論：與體內(nèi)研究結(jié)果相吻合的是：Aurora-A在體外水平可增強鼻咽癌CNE-2細

16、胞的EMT、侵襲及遷徙轉(zhuǎn)移能力。而Aurora-A上述惡性表型的獲得是通過MAPK1/2信號途徑實現(xiàn)的。該分子機制的闡明提示我們：靶向Aurora-A不僅可抑制鼻咽癌細胞生長增殖、誘導(dǎo)凋亡，而且可靶向逆轉(zhuǎn)細胞EMT表型、抑制細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力，充分證明了Aurora-A在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中的多維作用機制，進一步表明靶向Aurora-A在鼻咽癌治療中的光明應(yīng)用前景。
　　 第六章：VX-680對鼻咽癌細胞的放療增敏機制的研究。<

17、br>　　 目的：將VX-680與放射線同時作用于鼻咽癌細胞，探討VX-680是否具有放療增敏作用，并探討其分子機制，評價其臨床應(yīng)用潛能。
　　 方法：將VX-680與放射線同時處理鼻咽癌細胞，利用克隆形成實驗觀察鼻咽癌細胞的存活特點，從而明確其對射線的敏感性改變情況；應(yīng)用Western blot及流式細胞技術(shù)檢測細胞周期及射線敏感蛋白的表達情況，闡明VX-680增加鼻咽癌細胞放射線敏感性的分子機制。
　　 結(jié)果：CN

18、E-2細胞經(jīng)1-2 nM的VX-680預(yù)處理24小時，另經(jīng)12天左右的生長增殖后，平均有88.5％及85.2％的細胞存活；單獨予以1Gy劑量的放射線照射另經(jīng)12天左右的生長增殖，約有89.3％的細胞存活；1Gy+1/2 nM VX-680聯(lián)合處理并經(jīng)12天左右的生長增殖后，分別有68.8％及53.2％的細胞存活。
　　 結(jié)論：Aurora-A小分子抑制劑VX-680聯(lián)合放射線通過上調(diào)P53及P21的表達增加鼻咽癌細胞的放療敏感性