錳超氧化物歧化酶表達(dá)特性與食管癌關(guān)系的臨床基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤。我省西南部磁縣、涉縣地區(qū)是食管癌的集中高發(fā)區(qū)。其發(fā)病率、死亡率在國(guó)內(nèi)一直處于較高的水平。目前主要的治療手段是手術(shù)、化療及放療，但晚期腫瘤5年生存率僅在20％左右，其療效仍然不能令人滿意。因此探索新的提高癌細(xì)胞殺傷途徑成為研究熱點(diǎn)之一。
　　 錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)，由SOD2基因編碼的含錳超氧化物歧化酶

2、，位于人染色體6q25.3。MnSOD能將超氧自由基O2-轉(zhuǎn)化成H2O2，H2O2在過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和過氧化氫酶(catalase，CAT)的作用下分解為水和氧，使細(xì)胞無(wú)毒化，是人體細(xì)胞內(nèi)一種重要抗氧化酶。在乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌中存在著缺失或表達(dá)水平降低；而MnSOD過量表達(dá)可降低轉(zhuǎn)移率，并且能抑制或逆轉(zhuǎn)人的纖維母細(xì)胞SV40、惡性黑色素瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性表型及生長(zhǎng)，而被認(rèn)為

3、是一種新的抗癌基因，但其與食管癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。MnSOD啟動(dòng)子區(qū)上游9位點(diǎn)T→C轉(zhuǎn)換導(dǎo)致纈氨酸(Val)→丙氨酸(Ala)的氨基酸替換，可能通過降低本身活性使其對(duì)ROS的清除能力降低，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。研究顯示MnSOD低表達(dá)可能與MnSOD基因單核苷酸多態(tài)性有關(guān)。MnSOD的活性降低，造成細(xì)胞抗氧化損傷能力下降，腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性增加了肺癌、前列腺癌、乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但關(guān)于MnSOD(-9T＞

4、C)與華北地區(qū)高發(fā)的食管癌易感性之間的關(guān)系至今未見大樣本相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MnSOD過量表達(dá)并不總是抑制腫瘤的生長(zhǎng)，在骨肉瘤SaOS2細(xì)胞中，過高表達(dá)株明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，表現(xiàn)為平皿接種效率低，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，而中等表達(dá)細(xì)胞則較母細(xì)胞株的平皿接種效率高，倍增時(shí)間縮短。這種現(xiàn)象是否僅對(duì)骨肉瘤SaOS2特定細(xì)胞?對(duì)食管癌細(xì)胞的作用又如何?因此，我們?cè)噲D通過對(duì)食管癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染不同過量表達(dá)MnSOD基因，探討該基因過量表達(dá)在體內(nèi)和體

5、外對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響，以期探索腫瘤治療的新途徑。
　　 方法：
　　 1 全面收集1976-2009間發(fā)表的有關(guān)MnSOD基因多態(tài)性與食管癌、肺癌、前列腺癌發(fā)病關(guān)系的流行病學(xué)文獻(xiàn)，利用STATA11.0軟件根據(jù)文獻(xiàn)異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行固定效應(yīng)模型或隨機(jī)效應(yīng)模型的meta分析。對(duì)不同納入標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果進(jìn)行了敏感性分析，用漏斗圖、線性回歸法評(píng)估發(fā)表性偏倚。
　　 2 采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

6、(reverse transcription polymerase chine reaction,RT-PCR)及Western blot分別檢測(cè)45例食管鱗癌組織及距食管癌組織邊緣5cm以上的鏡下未見癌浸潤(rùn)的正常組織中MnSOD mRNA、蛋白的表達(dá)情況；并分析其與食管癌病理特征及生物學(xué)行為之間的關(guān)系。
　　 3 采用慢病毒轉(zhuǎn)染法將MnSOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌TE-1細(xì)胞，建立中、高過量表達(dá)MnSOD的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞（TE-1M

7、m細(xì)胞、TE-1Mh細(xì)胞）及空載體細(xì)胞（TE-1Mn細(xì)胞）。細(xì)胞免疫熒光、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TE-1細(xì)胞中MnSODmRNA和蛋白的表達(dá)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)、平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察細(xì)胞增殖、凋亡、周期變化情況。同時(shí)，將MnSOD轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種到裸鼠皮下檢測(cè)成瘤及腫瘤生長(zhǎng).情況；免疫組織化學(xué)（SP法）、RT-PCR及Westem blot檢測(cè)移植瘤中MnS

8、ODMnSOD mRNA、蛋白的表達(dá)水平。MTT法評(píng)價(jià)一氧化氮供體硝普鈉(sodium niitroprusside，SNP)、放射線及二者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞的抑制。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、RT-PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species，ROS)及一氧化氮供熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 共納入22個(gè)研究，合計(jì)20025例患者。對(duì)于食管癌，共納入4個(gè)研

9、究，共有620例患者，健康對(duì)照909例，Meta結(jié)果顯示MnSOD基因多態(tài)性明顯增加其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(Val/Ala versus Val/Val:OR=1.58，95％CI=1.22-2.04;Ala/Ala versus Val/Val:OR=2.25,95％CI=1.61-3.15; Ala/Ala versus Val/Ala+Val/Val:OR=1.69,95％ CI=1.07-2.67;Val/Ala+Ala/Ala versu

10、s Val/Val:OR=1.74，95％CI=1.36-2.22)。對(duì)于前列腺癌，共納入12個(gè)研究，共有4182患者，健康對(duì)照6885例，Meta結(jié)果顯示MnSOD基因多態(tài)性明顯增加了前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(Val/Ala versus Val/Val: odds ratio(OR)=1.11,95％ confidence interval(CI)=1.01-1.22;Ala/Ala versus Val/Val:OR=1.25,95％C

11、I=1.03-1.51;Val/Ala+Ala/Ala versus Val/Val:OR=1.15，95％CI=1.01-1.31）。然而，對(duì)于肺癌，共納入6個(gè)研究，共有3375患者，健康對(duì)照4050例，Meta結(jié)果顯示MnSOD基因多態(tài)性明顯降低了肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(Ala/Ala versus Val/Val:OR=0.68,95％CI=0.59-0.78;Ala/Ala versusVal/Ala+Val/Val:OR=0.71,9

12、5％CI=0.54-0.93;Val/Ala+Ala/Ala versusVal/Val:OR=0.83,95％CI=0.75-0.92)。
　　 2 免疫組織化學(xué)方法、RT-PCR及Western blot顯示：MnSOD蛋白和mRNA在食管鱗癌組織及正常食管組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為31.1％、86.7％,0.766±0.041、0.484±0.038，0.310±0.036、0.482±0.053，較正常食管組織明顯低(P＜

13、0.05)；病變?cè)介L(zhǎng)，浸潤(rùn)越深，分化越差，表達(dá)水平越低，顯示MnSOD蛋白和mRNA表達(dá)水平與食管鱗癌組織中的病變長(zhǎng)度、浸潤(rùn)深度及分化程度密切相關(guān)(P＜0.05)，但與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病變部位及大體病理類型無(wú)關(guān)(P＞0.05)。
　　 3 RT-PCR顯示，轉(zhuǎn)染MnSOD的TE-1細(xì)胞中含有不同表達(dá)水平的目的基因；細(xì)胞免疫熒光、免疫化學(xué)及Western blot顯示TE-1Mm細(xì)胞、TE-1Mh細(xì)胞含有不同表達(dá)水平的MnSOD蛋

14、白。
　　 4 MTT法顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種培養(yǎng)48h的細(xì)胞存活率，與對(duì)照細(xì)胞（TE-1細(xì)胞、TE-1Mn細(xì)胞）相比，TE-1Mm細(xì)胞的存活率下降，TE-1Mh細(xì)胞的存活率升高，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TE-1Mm細(xì)胞平皿克隆集落形成能力為23.0±2.7％，而TE-1Mh細(xì)胞為45.3±4.5％，分別低于、高于母細(xì)胞34.7±4.2％及空載細(xì)胞33.7±4.7％；組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

15、。
　　 5 Annexin V-PI雙染實(shí)驗(yàn)顯示：TE-1Mm和TE-1Mh細(xì)胞的早期細(xì)胞凋亡率10.6±1.0％和1.0±0.1％，分別高于和低于TE-1（2.6±0.2％）和TE-1n（2.5±0.3％）(P＜0.05)。FCM顯示，TE-1Mm和TE-1Mh細(xì)胞線粒體凋亡熒光指數(shù)分別為0.948±0.019和1.076±0.022，與母細(xì)胞TE-1（1.000±0.022）、空載體細(xì)胞TE-1n（0.997±0.023）

16、相比，差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。
　　 6 細(xì)胞周期：MnSOD過量表達(dá)使G0+G1期細(xì)胞數(shù)在TE-1Mm增多，在TE-1Mh減少；G2+M期和S期則在TE-1Mm減少，在TE-1Mh增多；與母細(xì)胞TE-1和空載體細(xì)胞TE-1n相比TE-1Mm細(xì)胞處在增殖期細(xì)胞少，而TE-1Mh細(xì)胞處在增殖期細(xì)胞多(P＜0.05)。
　　 7 FCM測(cè)得TE-1Mm細(xì)胞內(nèi)ROS熒光指數(shù)（0.859±0.040），低于TE-1細(xì)胞

17、（1.000±0.042）、空載體細(xì)胞（1.002±0.047）內(nèi)ROS熒光指數(shù)，但高于TE-1Mh細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光指數(shù)（0.763±0.039），組間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 8 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，TE-1Mm細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)后，腫瘤生長(zhǎng)慢，體積小，而TE-1Mh則相反，生長(zhǎng)速度明顯加快；其實(shí)體瘤中的MnSOD mRNA、蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 9 0.

18、5～2mmol/L SNP及2、4、6Gy放射線處理48h，TE-1Mm細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢；TE-1Mh細(xì)胞抑制率反而降低，細(xì)胞生長(zhǎng)加速。經(jīng)多靶單擊擬合細(xì)胞存活曲線，TE-1Mm細(xì)胞的D0、Dq及N值相對(duì)減小，SER值增加；而TE-1Mh細(xì)胞的模型參考值則與其相反。
　　 10 Annexin V-PI凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，SNP、2Gy照射、SNP+2Gy照射處理48h后，TE-1Mm細(xì)胞凋亡率分別為13.8±0

19、.7％、11.9±0.6％、29.6±1.1％，與TE-1Mh細(xì)胞相應(yīng)凋亡率3.3±0.3％、3.0±0.3％、9.5±0.6％相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 11 FCM顯示，SNP、2Gy照射、SNP+2Gy照射處理48h后，TE-1Mm細(xì)胞NO熒光指數(shù)分別為13.8±0.7％、11.9±0.6％、29.6±1.1％，與TE-1Mh細(xì)胞相應(yīng)熒光指數(shù)3.3±0.3％、3.0±0.3％、9.5±0.6％相比差異具

20、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 12 Western blot結(jié)果顯示，在相同時(shí)間(48h)作用下，TE-1Mm細(xì)胞MnSOD蛋白表達(dá)在各處理組相對(duì)量分別為0.334±0.029、0.485±0.040、0.175±0.011；與TE-1Mh細(xì)胞相應(yīng)蛋白表達(dá)量（0.415±0.038、0.604±0.059、0.234±0.024）相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 MnSOD

21、基因多態(tài)性增加前列腺癌、食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但卻能降低肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　 2 食管鱗癌組織中MnSOD蛋白和mRNA的表達(dá)均降低，可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性度相關(guān)。檢測(cè)MnSOD的表達(dá)能對(duì)食管癌的臨床治療和預(yù)后判斷有一定價(jià)值。
　　 3 兩種MnSOD表達(dá)水平的食管癌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功；MnSOD過量表達(dá)對(duì)食管癌TE-1細(xì)胞增殖具有抑制和促進(jìn)的雙向作用。
　　 4 中等過量表達(dá)MnSOD增加食管癌細(xì)胞放射敏