β3GnT8在結(jié)腸癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子c-jun對(duì)β3GnT8的調(diào)控作用.pdf

1、目的：研究糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制及探討轉(zhuǎn)錄因子c-jun對(duì)β3GnT8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　方法：⑴Tranwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)LS-174T,SW620,SW480, LoVo四株結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。⑵Western-blot檢測(cè)β3GnT8和CD147在四株結(jié)腸癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。⑶流式細(xì)胞術(shù)和Lectin-blot檢測(cè)四株結(jié)腸癌細(xì)胞株中多聚乳糖胺鏈的表達(dá)水平。⑷將β3

2、GnT8的真核正義表達(dá)載體及空載體、β3GnT8干擾載體及對(duì)照載體通過脂質(zhì)體分別介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174T和高轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo。⑸Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后LS-174T中β3GnT8上調(diào)后和LoVo細(xì)胞中β3GnT8下調(diào)后CD147糖基化的改變。⑹Tranwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后LS-174T中β3GnT8上調(diào)后和LoVo中β3GnT8下調(diào)后,其細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。⑺克隆轉(zhuǎn)錄因子c

3、-jun全長(zhǎng)基因序列并構(gòu)建c-jun正義表達(dá)載體。⑻將c-jun真核正義表達(dá)載體及空載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞,并通過G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。⑼熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染熒光載體的細(xì)胞株,RT-PCR和Western-blot檢測(cè)c-jun、β3GnT8和CD147的mRNA和蛋白表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)及Lectin-blot檢測(cè)c-jun對(duì)細(xì)胞糖蛋白中多聚乳糖胺鏈的表達(dá)影響;細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染c-jun后細(xì)胞增殖能力的變

4、化。
　　結(jié)果：①Transwell小室檢測(cè)四株結(jié)腸癌細(xì)胞株中侵襲和遷移能力發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力從低到高依次為L(zhǎng)S-174T,SW620,SW480,LoVo。②Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移程度的增加,β3GnT8和HG-CD147的表達(dá)也隨之升高,且β3GnT8和HG-CD147的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。③流式細(xì)胞術(shù)和Lectin-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,多聚乳糖胺鏈的表達(dá)也隨著結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移程度的增加而升高,并

5、且被多聚乳糖胺鏈修飾的CD147糖蛋白的分子量大小在49 kDa-90 kDa之間。④LS-174T中β3GnT8上調(diào)后,與空白對(duì)照組相比, HG-CD147的糖基化表達(dá)升高,其侵襲和遷移能力也增強(qiáng);LoVo細(xì)胞中β3GnT8下調(diào)后,與空白對(duì)照組相比,HG-CD147的糖基化表達(dá)下降,其侵襲和遷移能力也降低。⑤構(gòu)建c-jun正義表達(dá)載體,正反向測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫中BLAST同源檢索后顯示正義載體中插入的c-jun目的片段正確。⑥通

6、過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR、western-blot等檢測(cè),c-jun正義表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞并得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SGC-7901。⑦Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調(diào)后,與對(duì)照組相比β3GnT8和HG-CD147的表達(dá)均升高。(8)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調(diào)后,與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：⑵四株結(jié)腸癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力從低到高依次為L(zhǎng)S-174T,SW620, SW480