細(xì)胞自噬在電光葉蟬傳播水稻瘤矮病毒過(guò)程中的功能研究.pdf

1、水稻瘤矮病毒（RGDV）主要由介體電光葉蟬（Recilia dorsalis）進(jìn)行傳播。近年來(lái)關(guān)于電光葉蟬與RGDV互作方面的研究相繼增多，但在探究電光葉蟬先天免疫機(jī)制方面還不多。病毒通過(guò)侵染宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)其存活并增殖，自噬作為一種有效的防御途徑，可以保護(hù)細(xì)胞免于受病原微生物的侵害。明確 RGDV侵染介體電光葉蟬對(duì)細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響，可為闡明電光葉蟬傳播RGDV的特異性機(jī)理提供依據(jù)。
　　本研究主要探討 RGDV是否會(huì)誘導(dǎo)介體昆蟲(chóng)

2、培養(yǎng)細(xì)胞及蟲(chóng)體內(nèi)的自噬反應(yīng)，進(jìn)而影響自身的增殖和擴(kuò)散，以揭示 RGDV與介體昆蟲(chóng)互作的機(jī)制。首先分析電光葉蟬轉(zhuǎn)錄組中自噬Marker蛋白Atg8的基因和氨基酸序列，設(shè)計(jì)特異引物克隆 Atg8基因全長(zhǎng)片段。隨后連接至pDEST17原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Rosetta菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE后收集目的蛋白條帶，免疫小白鼠，制備抗Atg8多克隆抗體，并交聯(lián)熒光素。接下來(lái)利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)在 RGDV侵染的電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞中標(biāo)記自噬蛋白 At

3、g8和 RGDV外殼蛋白 P8，結(jié)果表明， RGDV侵染電光培養(yǎng)細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象的發(fā)生，并且自噬隨著RGDV在細(xì)胞內(nèi)的增殖擴(kuò)散而逐漸增強(qiáng)。進(jìn)一步解剖攜帶RGDV的電光葉蟬組織器官，運(yùn)用免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)自噬蛋白 Atg8與RGDV外殼蛋白P8在各個(gè)組織器官中的定位情況，結(jié)果表明自噬現(xiàn)象僅發(fā)生在電光葉蟬中腸中，唾液腺、精巢和卵巢中均未見(jiàn)特異的顆粒狀的自噬蛋白。這表明RGDV僅誘導(dǎo)了電光葉蟬中腸的自噬反應(yīng)。
　　為了明確 RGD

4、V誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)病毒增殖和擴(kuò)散的影響，采用自噬抑制劑（3-MA）和誘導(dǎo)劑（Rapamycin）以及RNA干擾（RNAi）處理電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞和蟲(chóng)體抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，免疫熒光標(biāo)記和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果都顯示誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，有利于病毒在細(xì)胞或蟲(chóng)體內(nèi)的擴(kuò)散，抑制自噬則不利于病毒的擴(kuò)散。傳毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)介體昆蟲(chóng)的傳毒效率。
　　因此，RGDV侵染電光葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞和蟲(chóng)體均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，且誘導(dǎo)自噬可促進(jìn) RGD