肺炎支原體外毒素CARDS TX的制備及特性研究.pdf

1、背景和目的:
　　最新研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體（Mycoplasma penumoniae，MP）毒力因子——社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(Community-acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)參與MP侵犯呼吸道等病理生理過程。CARDS TX是由MP基因MPN372編碼表達(dá)的68KDa蛋白質(zhì)，主要分布于MP胞膜表面和胞質(zhì)，具有二磷酸腺苷核糖轉(zhuǎn)移酶（ADP-rib

2、osyltransferase，ART）活性，能造成宿主細(xì)胞空泡化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，參與了MP肺炎等疾病過程。因而被認(rèn)為是MP的一個(gè)重要毒力因子，對(duì)其的深入研究可能為MP感染的發(fā)病機(jī)制提供了一個(gè)新的研究方向。
　　本研究擬在體外重組表達(dá)并純化具有活性的CARDS TX，并制備其兔多克隆抗體。為了更好的闡明CARDS TX的特性以及其在MP感染發(fā)病機(jī)制中的作用，我們進(jìn)一步研究了CARDS TX在人肺腺癌A549細(xì)胞中的定位，對(duì)DN

3、A損傷的影響及對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮RPE細(xì)胞纖毛長(zhǎng)度的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建帶有His-tag的表達(dá)載體Pet28b(+)-CARDS，經(jīng)Ni柱純化得到單一重組的CARDS TX（rCARDS TX）。
　　2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　3.免疫熒光法檢測(cè)MP或rCARDS TX處理A549細(xì)胞后CARDS TX在細(xì)胞的分布，及其與MP粘附的關(guān)系。
　　4.免疫熒光法檢測(cè)

4、γH2AX。
　　5.免疫熒光法檢測(cè)人視網(wǎng)膜色素上皮RPE細(xì)胞纖毛的長(zhǎng)度。
　　結(jié)果:
　　1.采用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定質(zhì)粒PET-28b(+)-CARDS，凝膠電泳可見CARDS TX基因片段大小為1773 bp。通過考馬斯亮藍(lán)染色，純化的rCARDS TX蛋白清晰可見。
　　2.rCARDS TX處理的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，且部分細(xì)胞出現(xiàn)了空泡化，50μg/ml處理組細(xì)胞空泡化嚴(yán)重并導(dǎo)致

5、細(xì)胞死亡，細(xì)胞數(shù)目減少。MTT試驗(yàn)顯示rCARDS TX處理的A549細(xì)胞存活率明顯下降。
　　3.免疫熒光顯示CARDS TX在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有分布，胰酶處理MP后，CARDS TX在細(xì)胞內(nèi)的分布減少。
　　4.rCARDS TX處理A549細(xì)胞后細(xì)胞核內(nèi)形成γH2AX焦點(diǎn)。
　　5.MP或rCARDS TX處理RPE細(xì)胞后，纖毛長(zhǎng)度明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.成功的構(gòu)建Pet28b(