轉染反義c-erbB-2 mRNA對子宮內膜癌ISHIKAWA及HEC-1A細胞株生長抑制作用的研究.pdf

1、目的:基因的突變及過渡表達導致的癌基因激活是多數腫瘤發(fā)病的重要因素。由于mRNA較DNA更易有效地進行操控，因而通過阻斷基因的蛋白合成來有效地抑制相關基因就成為最近研究的熱點。目前，通過阻斷已發(fā)生突變或過渡表達基因mRNA的方法在治療腫瘤、心血管性疾病及病毒性疾病等的研究中已有大量的報。反義技術具有選擇性高、對靶目標親和力強、生效快速、機制確切、易于操控及副作用少等特點，從而使其成為目前有效地抑制相關基因的常用的方法，并且在乳腺癌及卵巢

2、癌等腫瘤的研究中已取得了可喜的成果。然而，在子宮內膜癌的研究中還未見相應的報道。已知c-erbB-2(HER-2/neu)是子宮內膜癌主要的原癌基因，在內膜癌的生物學行為中起著重要的作用，其過度表達是內膜癌預后不良的重要因素。因而，本研究的目的即為評價轉染c-erbB-2反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASODNs)對高分化子宮內膜癌ISHIKAWA細胞株及中分化子宮內膜癌HEC-1A細胞株生長抑制作用

3、的效果。
　　 方法:
　　 1.C-erbB-2在子宮內膜癌中的表達以及與內膜癌臨床病理因素之間的關系
　　 免疫組化：通過免疫組化S-P方法檢測C-erbB-2蛋白在10例子宮內膜不典型增生及31例不同期別、不同組織分級、不同肌層浸潤深度的子宮內膜癌組織中的表達，分析其表達強度與子宮內膜癌臨床及病理因素之間的關系。
　　 2.轉染反義c-erbB-2 mRNA對高分化子宮內膜癌ISHIKAWA細胞株及

4、中分化HEC-1A細胞株生長抑制作用的研究
　　 2.1細胞培養(yǎng)
　　 將ISHIKAWA及HEC-1A細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Gibco)及50μg/ml青霉素和鏈霉素的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中。孵箱溫度為37℃，CO2濃度為10％，每周傳代2次。培養(yǎng)細胞用于各項實驗研究。
　　 2.2免疫組化
　　 ISHIKAWA及HEC-1A細胞培養(yǎng)于蓋玻片48h，待玻片細胞融合率達75％以上后，采用S

5、-P法免疫組化檢測c-erbB-2蛋白在細胞膜上的表達情況。
　　 2.3 C-erbB-2 ASODNs轉染ISHIKAWA及HEC-1A細胞
　　 上述培養(yǎng)細胞于對數生長期，經0.25％胰酶消化后加入DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液。計數后，接種于96孔板，每孔接種5×103個細胞加100ulDMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，待細胞融合率達90％以上時進行轉染。轉染試劑為Lipofectamine2000。
　　 2.

6、4透射電鏡觀察各組細胞超微結構的變化
　　 兩種培養(yǎng)細胞于對數生長期經0.25％胰酶消化后，DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于A、B、C、D、E及a、b、c、d、e、10個培養(yǎng)瓶內(75cm2)，每瓶接種細胞數為1×107，加20ml DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。待融合率達90％以上后，吸凈培養(yǎng)液，5ml DM液輕輕沖洗細胞表面2次。 A/a瓶內加入10 ml DM液，作為正常對照。 B/b、C/c、D/d瓶分別加入10ml

7、DM液稀釋的濃度為0.3uM的ASODNs/lipofectamine2000轉染液、ASODNs對照液、SODNs/lipofectamine2000轉染液，E/e瓶加入10 ml相應濃度的lipofectamine2000對照液。培養(yǎng)24h后，每瓶再加入10ml含10％胎牛血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細胞行透射電鏡檢測。
　　 2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡
　　 將兩種細胞接種于6孔板的5個孔內

8、，標記為A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1。每孔細胞密度為1×106。 A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1分別為正常對照，ASODNs轉染，ASODNs對照，SODNs轉染，及l(fā)ipofectamine2000對照。轉染濃度為0.3uM。轉染后收集細胞經流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　 2.6 RT-PCR assay
　　 細胞培養(yǎng)、轉染及細胞收集同流式細胞術步驟，每一標本

9、含1x106個細胞。轉染細胞消化、收集、洗滌、沉淀后以Trizol(Invitrogen)試劑提取各標本總RNA(詳見試劑操作說明)。采用TaKaRa試劑盒(AMV，TaKaRa Bio.，Japan)行RT-PCR檢測c-erbB-2 mRNA表達變化情況。
　　 2.7 western blot分析
　　 細胞培養(yǎng)、轉染、收集及洗滌同電鏡步驟。每一標本1×107細胞。轉染后的細胞行western blot檢測c-er

10、bB-2蛋白表達的變化。
　　 結果:
　　 1.C-erbB-2在子宮內膜癌中的表達以及與內膜癌臨床病理因素之間的關系
　　 1.1 c-erbB-2在子宮內膜非典型增生及子宮內膜癌組織中的表達c-erbB-2在子宮內膜非典型增生及內膜癌組織中的陽性表達率分別為40％及58％，二者的差異無統計學意義(P＞0.05)。
　　 1.2子宮內膜癌中c-erbB-2的表達與臨床、病理因素的相關性c-erbB-2

11、在子宮內膜癌中陽性表達率與腫瘤的病理組織分級呈正相關(P＜0.05)，其陽性表達率隨腫瘤病理分級的增高而增高。 c-erbB2的陽性表達率與患者的年齡、腫瘤浸潤肌層深度、激素受體狀態(tài)(ER、PR)、淋巴結有無轉移、臨床手術-病理分期無相關性(P＞0.05)。
　　 2、轉染反義c-erbB-2 mRNA對高分化子宮內膜癌ISHIKAWA細胞株生長的抑制作用
　　 2.1免疫組化
　　 c-erbB-2蛋白在ISH

12、IKAWA及HEC-1A細胞膜上呈陽性表達。
　　 2.2轉染c-erbB-2 ASODNs后光鏡下細胞形態(tài)的變化
　　 隨著轉染ASODNs濃度由0.1uM～0.6uM逐漸增加，兩種細胞均逐漸呈現皺縮、破壞甚至崩解。而未加轉染試劑單純用0.6uM ASODNs處理的細胞、0.6uM SODNs轉染的細胞以及單純用轉染0.6uM ASODNs所需濃度的Lipofectamine2000處理的細胞其光鏡下形態(tài)學變化與正常對

13、照細胞差異不大。
　　 2.3轉染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后電鏡下細胞超微結構的變化
　　 轉染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后ISHIKAWA及HEC-1A細胞漿內均發(fā)生明顯空泡變性、細胞器消失、胞核明顯皺縮、結構消失。未加轉染試劑單純用0.3uM ASODNs處理的細胞其胞漿內僅出現輕度的空泡變性，細胞器存在，細胞核結構清晰。而轉染0.3uM SODNs的細胞及單純用轉染0.3uM AS

14、ODNs所需濃度的Lipofectamine2000處理的細胞其超微結構與正常對照細胞相比無明顯變化。
　　 2.4轉染0.1uM～0.6uM c-erbB-2 ASODNs后MTr檢測細胞生長抑制情況
　　 隨著ASODNs轉染濃度的增加，兩種細胞生長抑制強度逐漸加強。而SODNs轉染組及單純用Lipofectamine2000處理組，隨著濃度的增加細胞生長抑制性表現不明顯。
　　 2.5流式細胞術檢測各組細胞

15、凋亡率用0.3uM ASODNs轉染兩種細胞后，其凋亡率較其它組明顯升高。
　　 2.6 RT-PCR及Western blot分析
　　 轉染0.3uM ASODNs的兩種細胞，其c-erbB-2 mRNA及蛋白表達量較其它組明顯降低。
　　 結論:
　　 1.c-erbB-2在子宮內膜癌中陽性表達率與腫瘤的病理組織分級呈正相關關系。
　　 2.隨著轉染ASODNs濃度由0.1uM～0.6uM逐