正常人與肺結(jié)核病人rhIL-2擴增的CD3+CD56+NKT細胞生物學活性的比較研究.pdf

1、研究背景：ΝΚΤ（natural killer T)細胞是一群細胞表面既有T細胞受體(TCR)，又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群。該群細胞具有抗感染，抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)等多重功能。雖然共表達T細胞受體和NK細胞受體可以作為NKT細胞的表型指標，但是NKT細胞是一個復雜的異質(zhì)性群體，其確切的定義仍未取得一致意見。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn) CD3+CD56+NKT細胞是細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)中的

2、主要效應細胞，其含量的多少與CIK的細胞毒活性的高低有關(guān)。目前 CIK過繼免疫治療腫瘤的方法在臨床已得到應用，但是針對結(jié)核病的細胞過繼免疫療法還很少研究。由于結(jié)核病的致病菌結(jié)核桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，機體對它的消滅也依賴細胞免疫，所以有關(guān)結(jié)核病的細胞過繼免疫療法的研究有望成為攻克結(jié)核病的一個全新的領(lǐng)域。
　　目的：從活化規(guī)律、細胞數(shù)量、表型和分泌細胞因子四方面比較正常人與肺結(jié)核病人新鮮外周血中 CD3+CD56+NKT細胞的差異；分

3、別觀察正常人與肺結(jié)核病人PBMC(peripheral blood mononuclear cells)用rhIL-2刺激后CD3+CD56+NKT細胞的增殖規(guī)律，再從細胞數(shù)量、表型和分泌細胞因子三方面比較正常人與肺結(jié)核病人rhIL-2擴增后的CD3+CD56+NKT細胞的差異，以期為探討肺結(jié)核病的發(fā)病機制和治療方法開辟一個新的道路。
　　方法：
　　1.淋巴細胞各亞群的檢測方法：正常人與肺結(jié)核病人外周靜脈血收集于肝素鈉抗凝

4、的真空采血管內(nèi)，于4小時內(nèi)完成流式抗體染色處理過程，利用流式細胞儀獲取數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，最終得出淋巴細胞各亞群的數(shù)值。
　　2.活化指標 CD69的檢測方法：密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞(PBMC)，用rhIL-2刺激PBMC，分別于刺激后0、8、16、40和64小時檢測NK細胞和NKT細胞表面CD69的表達情況。
　　3. rhIL-2擴增 NKT細胞的方法：密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞(PBMC)，加入 rhI

5、L-2刺激培養(yǎng)人外周血單個核細胞(PBMC)，以后每2-3天補充rhIL-2和新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞兩周，分別于培養(yǎng)第0、6、10和14天檢測NKT細胞比例并計數(shù)。
　　4. NKT細胞的表型和胞內(nèi)細胞因子檢測：于培養(yǎng)第0天和第14天收集細胞，流式細胞儀檢測NKT細胞的表面分子γδTCR、CD4、CD8和CD161的表達情況以及胞內(nèi)細胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-17的分泌量。
　　結(jié)果:

6、
　　1.肺結(jié)核病人(n=42)與正常人(n=30)相比，NKT細胞和 Th細胞比例未發(fā)生顯著變化，NK細胞比例顯著增加(P<0.05)，Th/Tc比值顯著增加(P<0.01)，而T細胞、γδT細胞、Tc細胞和B細胞都顯著降低(P<0.01)。
　　2. PBMC經(jīng)rhIL-2刺激0h、8h、16h、40h和64h后，正常人NK細胞和NKT細胞表面CD69表達量均顯著增加（與0 h比較，P<0.01）。肺結(jié)核病人NK細胞和N

7、KT細胞表面CD69表達量也顯著增加（與0 h比較，P<0.01）。肺結(jié)核病人組與正常組比較，NK細胞表面CD69表達量除0 h無顯著差異（P>0.05），其余各時間點表達量均高于正常組（P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05）；NKT細胞表面CD69表達量除64 h無顯著差異（P>0.05），其余各時間點表達量均高于正常組（P<0.01、P<0.05、P<0.05、P<0.01）。
　　3.正常人PBMC在rhI

8、L-2刺激培養(yǎng)14天后，細胞總數(shù)由（0.86±0.18）×106擴增到（38.28±4.56）×106（P<0.01），細胞擴增了45.79±7.77倍；NKT細胞絕對數(shù)則由（5.57±5.16）×104擴增到（1475.05±868.98）×104（P<0.01），細胞擴增了246.26±134.06倍；NKT細胞相對比例由（5.14±2.11）％擴增到（38.57±21.95）%（P<0.01）。結(jié)核病人外周血單個核細胞在rhIL-

9、2刺激下也會顯著擴增，細胞總數(shù)由（0.95±0.19）×106擴增到（18.15±1.73）×106（P<0.01），細胞擴增了19.77±4.82倍；NKT細胞絕對數(shù)由（3.44±1.20）×104擴增到（323.23±75.98）×104（P<0.01），細胞擴增了108.69±59.22倍；NKT細胞相對比例由（3.67±1.25）%擴增到（17.67±3.23）%（P<0.01）。兩組比較，肺結(jié)核病人NKT細胞擴增效率顯著低于正

10、常人。
　　4.正常人外周血中NKT細胞高表達CD8，擴增后的NKT細胞則高表達γδTCR、CD161；結(jié)核病人外周血中NKT細胞CD8表達量低于正常人，擴增后NKT細胞γδTCR降低， CD8、CD4、CD161的表達量則增高，γδTCR、CD4的表達量低于正常人，CD8、CD161的表達量則高于正常人。
　　5.正常人外周血中NKT細胞能夠分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17，擴增后NKT細胞分泌IFN-γ、

11、TNF-α的量顯著增加；肺結(jié)核病人外周血中NKT細胞也能夠分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-4和 IL-17，但擴增前后這些細胞因子的量無差異；正常人擴增后的NKT細胞分泌IFN-γ、TNF-α的量顯著高于肺結(jié)核病人。
　　結(jié)論：
　　1.肺結(jié)核病人的T細胞、γδT細胞、Tc細胞和B細胞低于正常人，NK細胞、Th/Tc比值高于正常人，而NKT細胞、Th細胞則與正常人相似。
　　2.肺結(jié)核病人NK細胞，NKT細胞的活化