轉(zhuǎn)染INPP4B基因聯(lián)合PARP抑制劑對雄激素抵抗型前列腺癌PC3細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：
　　前列腺癌屬于男性泌尿生殖系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤。在歐美男性中，前列腺癌占惡性腫瘤相關(guān)死因的第二位，為首發(fā)的癌癥。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，在2013年有238，590名男性患有前列腺癌，其中29，720會死于前列腺癌或是前列腺癌相關(guān)的疾病。前列腺癌在我國的發(fā)病率雖然尚無歐美國家的發(fā)病率高，然則卻也在隨著國人生活水平的提高而逐年升高，目前在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中，其發(fā)病率已上升為的第3位。內(nèi)分泌治療是目前全球前列腺癌治療的首選

2、，但是臨床上會觀察到應(yīng)用內(nèi)分泌治療一段時間后病人不可避免的會產(chǎn)生激素抵抗，或是有些病人在醫(yī)治初始即對內(nèi)分泌治療耐藥，研究者將此稱為雄激素抵抗型前列腺癌。此類前列腺癌可以看做是前列腺癌發(fā)展的終末環(huán)節(jié)，可供選擇的治療方案相當(dāng)有限，且病情進(jìn)展較快，嚴(yán)重威脅病人的生命及降低生活質(zhì)量。因此，此型前列腺癌不僅是前列腺癌治療的難點也是治療重點。如何尋找人雄激素抵抗型前列腺癌有效的治療靶點及相應(yīng)的診療方法，已經(jīng)成為目前前列腺癌基礎(chǔ)及臨床研究的重要領(lǐng)域。

3、
　　越來越多的研究認(rèn)為多聚磷酸肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是新的抑癌基因，負(fù)向調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路。在人類前列腺癌中，雄激素受體(AR)在轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)節(jié)INPP4B，有研究認(rèn)為激素抵抗型前列腺癌細(xì)胞可能不表達(dá)AR，且與正常組織相比，前列腺癌組織INPP4B的表達(dá)減少。這些使我們推測如果此類腫瘤細(xì)胞中重新表達(dá)INPP4B能夠抑制腫瘤的生長。雄激素抵抗型前列腺癌常伴有10號染色體

4、缺失的磷酸酶基因(PTEN)功能異常，最終致使同源重組修復(fù)缺陷。在此類腫瘤中應(yīng)用聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP)抑制劑能阻斷DNA損傷修復(fù)的代償通路，有效殺傷腫瘤細(xì)胞。同時有研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在PARP過表達(dá)，包括雄激素抵抗型前列腺癌，提示PARP抑制劑可能在此類前列腺癌中發(fā)揮治療作用。然而也有報道稱，PARP抑制劑能上調(diào)p-AKT水平，激活PI3K/AKT信號通路，從而影響療效并產(chǎn)生耐藥。
　　綜上，本研究試圖觀察轉(zhuǎn)染I

5、NPP4B基因是否在抑制PC3細(xì)胞增殖的同時下調(diào)其p-AKT水平，與PARP抑制劑聯(lián)合能否發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。
　　目的：
　　研究轉(zhuǎn)染INPP4B基因、PARP抑制劑處理應(yīng)用對雄激素抵抗型前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3增殖的影響及兩者聯(lián)合應(yīng)用能否對此類腫瘤細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)PC3細(xì)胞及LNcap細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測PC3細(xì)胞中INPP4BmRNA的表達(dá)情況（以LNca

6、p為陽性對照）。PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染INPP4B基因后實時定量PCR檢測INPP4BmRNA的相對含量;Westernblot檢測PC3細(xì)胞中INPP4B蛋白的表達(dá)。實驗設(shè)CON組、Lenti-INPP4B組、Lenti-GFP組、PARP抑制劑組、Lenti-INPP4B與PARP抑制劑聯(lián)合組、Lenti-GFP與PARP抑制劑聯(lián)合組，CCK-8法、Westernblot、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測PC3細(xì)胞在各種處理后增殖、細(xì)胞中p-AKT表達(dá)水

7、平、細(xì)胞凋亡及周期分布的改變。
　　結(jié)果：
　　INPP4BmRNA在PC3細(xì)胞中呈陰性表達(dá)。轉(zhuǎn)染攜帶INPP4B基因的重組慢病毒后，實時定量PCR顯示Lenti-INPP4B組的INPP4BmRNA相對水平為(87.84±7.62);Westernblot檢測顯示在INPP4B蛋白分子量處出現(xiàn)條帶，顯示INPP4B在PC3細(xì)胞中成功表達(dá)。轉(zhuǎn)染病毒組:CCK-8法顯示在轉(zhuǎn)入病毒的第24h、36h、48h，Lenti-INPP

8、4B組細(xì)胞活力分別為（66.18％±2.32）％、（45.10±0.00）％、（29.35±3.19）％，與Lenti-GFP組細(xì)胞活力相比，差異有顯著性意義(P＜0.05);流式細(xì)胞凋亡分析顯示:Lenti-INPP4B組與Lenti-GFP組凋亡比例分別為5.48％、2.85％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;Westernblot顯示Lenti-INPP4B組與Lenti-GFP組相比，p-AKT水平降低。PARP抑制劑組:CC

9、K-8法顯示0.1、1、10、20、40μM五個濃度的AG014699及DMSO作用48h，各組細(xì)胞平均活力分別為（93.58±3.51）％、（64.6±2.18）％、(57.15±3.38)％、(43.88±3.02)％、（40.60±0.86）％、(99.76±0.06)％，除0.1μM的AG014699外，剩下各濃度的PARP抑制劑對PC3細(xì)胞增殖的抑制作用與DMSO相比差異均有顯著性意義(P＜0.05);10μM最接近且小于IC

10、50，將10μM選為單藥及轉(zhuǎn)染INPP4B基因聯(lián)合的合適濃度;AG014699(10μM)作用24、36、48h，各組PC3細(xì)胞平均活力分別為（88.53±1.73）％、（60.77±2.26）％、(54.12±1.96)％，與DMSO相比差異均有顯著性意義(P＜0.05);PI染色周期分布顯示:1、10、20μM的AG014699作用48h后，G2/M期細(xì)胞比例分別為（23.50±2.90）％、（35.10±5.11）％、（55.97

11、±3.75）％，顯示隨著藥物濃度升高，G2/M期比例逐漸增加，高濃度的PARP抑制劑能將細(xì)胞阻滯在G2/M期;AnnexinⅤ-FITC/PI流式分析顯示，1、10、20μM的AG014699作用于PC3細(xì)胞48h，凋亡率分別為6.54％、12.16％、23.53％，顯示隨著藥物濃度增加，凋亡率逐漸增加;同時觀察到細(xì)胞內(nèi)p-AKT水平隨著PARP抑制劑濃度的升高而增加。轉(zhuǎn)染INPP4B基因聯(lián)合PARP抑制劑:首先倒置顯微鏡下觀察到聯(lián)合組

12、與單獨處理組相比，細(xì)胞數(shù)目明顯減少、細(xì)胞皺縮且形態(tài)不規(guī)則;CCK8法檢測顯示細(xì)胞活力在24、36、48h分別為(49.85±0.30)％、(26.30±1.81)％、（9.72±3.10）％，與Lenti-INPP4B組、PARP抑制劑組單獨作用相比，對PC3細(xì)胞增殖抑制有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);PI染色周期分布顯示，聯(lián)合組細(xì)胞阻滯在G1期;AnnexinⅤ-FITC/PI流式檢測顯示PARP抑制劑組、Lenti-INPP4B與PA

13、RP抑制劑聯(lián)合組凋亡比例分別為12.16％、17.71％，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;相對于PARP抑制劑組，聯(lián)合組細(xì)胞內(nèi)p-AKT水平明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.人雄激素抵抗性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3不表達(dá)INPP4B。
　　2.轉(zhuǎn)染INPP4B基因能夠?qū)C3細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　3.PARP抑制劑單獨作用于PC3細(xì)胞能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　4.轉(zhuǎn)染INPP4B基因聯(lián)合PARP抑制劑在