RNA干擾Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)胞MNK-45凋亡及血管生成的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建并鑒定Nodal基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人胃腺癌癌細(xì)胞MNK-45，沉默人胃腺癌癌細(xì)胞MNK-45中Nodal，探討Nodal基因?qū)θ宋赶侔┌┘?xì)胞MNK-45凋亡及血管生成的影響。
　　方法：1）針對(duì)Nodal mRNA設(shè)計(jì)合成3條siRNA，及設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照siRNA。退火形成雙鏈DNA，與熒光載體（GV248）連接，對(duì)構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，如測(cè)定序列與目的序列一致，提示插入Nodal基因RNA

2、i序列正確。2）對(duì)重組慢病毒載體進(jìn)行包裝及鑒定，對(duì)測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提并與3種質(zhì)粒載體（重組質(zhì)粒及pHelper1.0、pHelper2.0）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后96h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度。3）將慢病毒感染人胃腺癌細(xì)胞MNK-45。感染72h后，進(jìn)行熒光倒置顯微鏡觀察感染效率。qPCR檢測(cè)Nodal基因的表達(dá)。4）shRNA慢病毒感染MKN-45細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，使用eBioscience的凋亡檢測(cè)

3、試劑盒及流氏細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。5）采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）三維培養(yǎng)法分析慢病毒感染MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)血管形成的影響。Cellomics儀觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）血管面積、平均血管長(zhǎng)度、平均血管寬度、血管節(jié)點(diǎn)數(shù)來評(píng)估血管生成情況。
　　結(jié)果：（1）重組慢病毒載體的測(cè)序：對(duì)構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)定序列與目的序列一致。提示插入Nodal基因RNAi序列正確。（2）重組慢病

4、毒載體的包裝及鑒定：將3種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后96h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，見細(xì)胞生長(zhǎng)良好，熒光強(qiáng)烈。測(cè)定病毒滴度為5×108TU/ml。（3）qPCR檢測(cè)RNA干擾后Nodal基因的表達(dá)：RNAi慢病毒感染后，MKN-45細(xì)胞Nodal基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。LV-NODAL-RNAi(44787-1)感染、LV-NODAL-RNAi(44789-1)感染分別下調(diào)了80.3％和84.9%。(4)RNA干擾Nodal基因?qū)KN-4

5、5細(xì)胞凋亡的影響:shRNA慢病毒感染MKN-45細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，干擾組凋亡率與對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.05）。(5)對(duì)體外HUVEC細(xì)胞血管生成的影響:96孔板中鋪Matrigel，用收集的目的細(xì)胞培養(yǎng)上清液重懸HUVEC細(xì)胞，鋪96孔板。培養(yǎng)后加入Calcein AM，室溫孵育。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組血管生成主要相關(guān)參數(shù)中，血管面積、平均血管長(zhǎng)度、平均血管寬度、血管節(jié)點(diǎn)數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：