紫檀芪通過抑制JAK2-ST AT3信號(hào)通路抗人骨肉瘤細(xì)胞活性研究.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是一種兒童及青少年最常見的惡性骨腫瘤,高發(fā)于四肢長(zhǎng)骨的干骺端。目前常規(guī)的化療藥物均為細(xì)胞毒性藥物,副作用大。幾乎一半的兒童期腫瘤幸存者因?yàn)榭鼓[瘤治療至少承受一個(gè)不良后果?；熕幬镌缙诙拘园ㄑ合到y(tǒng)毒性,急性肝臟毒性和腎毒性。生存期的延長(zhǎng)導(dǎo)致了晚期化療毒性的增加。主要的晚期毒性有:心臟毒性、繼發(fā)腫瘤、不育、慢性腎衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)毒性。因此尋找低毒的抗骨肉瘤藥物具有重要的臨床意義。
　　紫檀芪(PTE)是一

2、種來源于我們食物的天然化合物,毒性極低,對(duì)人體是安全的。PTE是白藜蘆醇的二甲基化類似物,具有多種生物學(xué)活性,可以抗炎、抗氧化、抗增殖、抗腫瘤及止痛。因甲氧基團(tuán)替代了羥基增加了親脂性,增加了生物利用度,從而增加了活性。研究表明PTE可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡,包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌及白血病等。PTE是否具有抗骨肉瘤作用目前尚無人研究。
　　PTE抗腫瘤作用涉及多種細(xì)胞分子和信號(hào)通路,如單磷酸腺苷活化激酶(A

3、MPK)、細(xì)胞基質(zhì)鈣超載、活性氧(ROS)、自噬、Wnt信號(hào)通路及溶酶體膜通透作用增強(qiáng)等,但具體的抗腫瘤機(jī)制目前尚不清楚。JAK/STAT通路對(duì)體內(nèi)多種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)都非常的關(guān)鍵,對(duì)多種哺乳動(dòng)物發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定都異常的重要。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2,這4個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)及功能相似。JAK的活化在細(xì)胞增殖、分化、遷移及凋亡中均有重要的作用。結(jié)構(gòu)活化的JAKs會(huì)使細(xì)胞內(nèi)許多重要的物質(zhì)磷酸化,其中包括STAT家族,ST

4、AT家族中的STAT3與許多腫瘤的信號(hào)通路相關(guān)。結(jié)構(gòu)活化后的STAT3和人實(shí)體腫瘤細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)關(guān)系密切。STAT3還可上調(diào)人腫瘤細(xì)胞抗凋亡基因編碼的Mcl-1、Bcl-xL蛋白。PTE可以抑制STST3的磷酸化,磷酸化的STST3是一種腫瘤快速生長(zhǎng)的標(biāo)志。更為重要的是活化的JAK2/STAT3信號(hào)作為治療實(shí)體腫瘤一個(gè)重要的目標(biāo)分子已經(jīng)被廣泛的確認(rèn)其有效性。PTE抗骨肉瘤的作用是否與抑制JAK2/STAT3通路的磷酸化程度有關(guān)目前尚不

5、清楚。
　　第一部分：PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性研究
　　研究目的：
　　研究PTE對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響;研究PTE對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞遷移及粘附能力的影響。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　人骨肉瘤細(xì)胞系SOSP-9607(9607),復(fù)蘇后在10％的胎牛血清DMEM液中培養(yǎng),加入L-谷酰胺、青霉素、鏈霉素及HEPES液。孵箱內(nèi)溫度維持在37°C,CO2濃度為5%。收集細(xì)胞備用。

6、>　　PTE原液中加入二甲基亞砜,以培養(yǎng)液稀釋,即配即用。對(duì)照組中加入0.01%的二甲基亞砜。實(shí)驗(yàn)組加入PTE,濃度梯度為1、2及4μM。
　　2.細(xì)胞活力檢測(cè)
　　細(xì)胞預(yù)處理后以PBS液洗滌三次,加入MTT液,37°C的孵箱中孵育4h,加入二甲基甲酰胺,震蕩,在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞活力以各孔吸光值(OD)的形式記錄,測(cè)定各孔光吸收值,記錄結(jié)果,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。并在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、照相。

7、　　3.細(xì)胞周期分析
　　細(xì)胞預(yù)處理后胰酶消化,70%的乙醇固定后PBS液洗滌,加入核糖核苷酸及碘化丙啶,避光室溫下孵育30min。以配備數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)的流式細(xì)胞儀分析并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果以熒光密度分布圖的形式表示,熒光密度代表細(xì)胞數(shù)目。
　　4.線粒體跨膜電位(MMP)分析
　　將細(xì)胞放入六孔板中加入不同濃度的PTE,孵育24h。以PBS液洗滌,加入JC-1工作液,避光37°C孵育。細(xì)胞洗滌后懸浮于PBS液中,將染色

8、的細(xì)胞用上述流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果以較低MMP的細(xì)胞比例表示。
　　5.細(xì)胞凋亡分析
　　將細(xì)胞預(yù)處理后,冰PBS液沖洗,加入熒光標(biāo)記的共軛膜聯(lián)蛋白及碘化丙啶,使用上述流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況并用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。碘化丙啶陰性且共軛膜聯(lián)蛋白陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞,雙陰性細(xì)胞被認(rèn)為是正常細(xì)胞。
　　6.劃痕試驗(yàn)
　　培養(yǎng)細(xì)胞至鋪滿瓶底后,微量管尖端在單層細(xì)胞處制造劃痕。將分離的細(xì)胞以PBS洗滌干凈,加入PT

9、E24h后,使用顯微鏡觀察并記錄劃痕邊緣距離變化情況。結(jié)果以每組劃痕之間的距離數(shù)值表示。
　　7.細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)
　　PTE處理骨肉瘤細(xì)胞24h后消化、離心,懸浮在加入10%胎牛血清的DMEM液中。37°C下孵育30min,PBS液洗滌。將貼壁細(xì)胞用法MTT染色,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞粘附情況并照相。加入二甲基甲酰胺,37°C下震蕩孵育15min,在490nm條件下使用分光光度計(jì)測(cè)量,結(jié)果以O(shè)D值表示,將對(duì)照組OD值設(shè)為1

10、00%。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有的樣本一式兩份,重復(fù)至少3次,數(shù)據(jù)已平均值±標(biāo)注差的形式表示。實(shí)驗(yàn)組間比較使用SPSS12.0,采用方差分析的方法(ANOVA)。差異P<0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.PTE對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響
　　骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1,2及4μM濃度梯度的PTE后,分別培養(yǎng)12、24及36h,細(xì)胞生長(zhǎng)均出現(xiàn)抑制。PTE對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈

11、劑量和時(shí)間依賴。培養(yǎng)至24h時(shí)PTE的IC50(50%抑制濃度)約為1.81μM。與對(duì)照組比較,PTE導(dǎo)致細(xì)胞粘附率下降。加入1、2及4μMPTE后,與對(duì)照組相比較,凋亡指數(shù)分別增加16.75±3.91%、21.55±3.26%及35.87±4.23%(P<0.01)。我們發(fā)現(xiàn)凋亡指數(shù)呈劑量依賴性。這個(gè)結(jié)果說明PTE對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　2.PTE對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移及粘附能力的影響
　　加入1、2及4

12、μM的PTE,孵育24h后,隨著濃度的增加,劃痕邊緣的距離顯著增加,分別增加至對(duì)照組的123.07±9.05%、161.53±8.28%及223.08±11.30%(P<0.01)。粘附細(xì)胞顯著減少,粘附率分別為對(duì)照組的62.29±9.43%、34.38±6.70%及13.64±3.35%(P<0.01)。這些結(jié)果表明PTE可以降低骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力及粘附能力。
　　3.PTE對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MMP的影響
　　加入1、2及4μ

13、M的PTE,孵育24h后,低MMP細(xì)胞的比例顯著增加。各組低MMP的細(xì)胞比例分別增加至8.19±2.36%、16.17±2.68%及29.45±3.10%(與對(duì)照組比較,P<0.01)。結(jié)果表明PTE可以增加骨肉瘤細(xì)胞的MMP。
　　4.PTE對(duì)骨肉瘤細(xì)胞周期的影響
　　與對(duì)照組相比較,加入不同濃度的PTE后均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞G0-G1階段的聚積。G0-G1階段的細(xì)胞由對(duì)照組的33.27%增加至4μMPTE組的55.22%,可見P

14、TE會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期G0-G1期的阻滯。
　　結(jié)論：
　　PTE具有很強(qiáng)的抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的作用。PTE導(dǎo)致人骨肉瘤細(xì)胞G0-G1期阻滯,使細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制;同時(shí)PTE降低了MMP,誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。PTE還可以減少骨肉瘤細(xì)胞的粘附能力及遷移能力。
　　第二部分：PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的機(jī)制研究
　　研究目的：
　　研究PTE抗人骨肉瘤細(xì)胞活性的相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及處

15、理
　　同第一部分最后一步實(shí)驗(yàn)中加入AG490,PTE的濃度為4μM
　　2.細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及谷胱甘肽水平(GSH)檢測(cè)
　　細(xì)胞預(yù)處理后胰酶裂解,加入DCFH-DA液,37oC下孵育2h。FLX800微量盤熒光光譜儀測(cè)量每孔二氯熒光素的強(qiáng)度。無細(xì)胞孔作為背景,將對(duì)照組熒光強(qiáng)度定為100%。
　　細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中過夜后加入PTE24h后。PBS洗滌細(xì)胞。根據(jù)探針的操作指南,將細(xì)胞裂解后測(cè)量GSH的水平。在

16、測(cè)量前1h用2-乙烯基吡啶遮蔽GSH。GSH和GSSG的含量與正常標(biāo)準(zhǔn)的蛋白含量比較。結(jié)果以GSH的表達(dá)(%對(duì)照含量)或GSH/GSSG比例的形式表達(dá),使用還原形式的GSH或氧化形式的GSH(GSSG)作為標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.Westen Blotting
　　將細(xì)胞樣本在樣本緩沖液中裂解,降噪處理,煮沸,跑凝膠,轉(zhuǎn)膜,封閉。加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Mcl-1、CyclinD1、p21、p27、B

17、cl-xL、Bax、Bak及GAPDH的抗體4oC過夜。洗膜,加入對(duì)應(yīng)的二抗,室溫下放置90min,洗滌。使用BioRad成像系統(tǒng)觀察記錄熒光強(qiáng)度,并以ImageLab軟件定量分析。
　　4.細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的萃取
　　處理離心細(xì)胞,PBS液洗滌2次后懸浮于冰的細(xì)胞萃取緩沖液中,4oC下孵育40min,離心,上清液用來提取細(xì)胞色素C,加入5倍上清的緩沖液,100oC下煮沸7min,將蛋白溶液用Western blottin

18、g的方法測(cè)定細(xì)胞色素C的含量。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　同第一部分。
　　研究結(jié)果：
　　1.PTE對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞G0–G1阻滯,我們利用Western blotting的方法檢測(cè)周期蛋白D1、p21及p27的表達(dá)。與細(xì)胞周期阻滯一致,CyclinD1的表達(dá)水平降低,而p21和p27的表達(dá)水平升高。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明PTE可以導(dǎo)致細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　2.PTE

19、對(duì)骨肉瘤細(xì)胞活性氧生成及谷胱甘肽水平的影響
　　加入1、2及4μM的PTE,孵育24h后骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧呈劑量依賴關(guān)系,分別增加至對(duì)照組的255.32±12.97%、411.59±16.24%及503.61±17.05%(與對(duì)照組比較,P<0.01)。
　　加入1、2及4μM的PTE,孵育24h后骨肉瘤細(xì)胞谷胱甘肽水平呈劑量依賴性降低,分別降低了80.51±3.06%、66.43±3.82%及52.30±3.49%。

20、(與對(duì)照組比較,P<0.01)。PTE會(huì)導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的比例呈劑量依賴性降低。
　　3.對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路及線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的影響
　　加入PTE后磷酸化的JAK2及STAT3的表達(dá)水平降低。與磷酸化的JAK2及STAT3的表達(dá)下調(diào)相一致的是PTE使Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)水平也降低,且呈劑量依賴關(guān)系。除此之外PTE使線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白(Bax、Bak、細(xì)胞色素C)的

21、表達(dá)上調(diào)。
　　4.PTE聯(lián)合AG490對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞活力及JAK2/STAT3信號(hào)的影響
　　聯(lián)合應(yīng)用PTE(4μM)和AG490(一種已知的JAK2/STAT3抑制劑,20μM)進(jìn)一步抑制了骨肉瘤細(xì)胞的活力(與單獨(dú)的PTE組或AG490組比較,P<0.01)。并且聯(lián)合應(yīng)用PTE和AG490也進(jìn)一步抑制了JAK2及STAT3的磷酸化程度。
　　結(jié)論：
　　PTE通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路影響CDK/C