抗p-185的His6-H520C9scFv的真核載體、穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建及其蛋白活性研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建和鑒定表達(dá)抗p185且含His6標(biāo)簽的H520C9scFv的真核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。經(jīng)過(guò)G418的篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)His6-H520C9scFv的293細(xì)胞株,用RT-PCR、Westernblot檢測(cè)His6-H520C9scFv的表達(dá),及細(xì)胞免疫熒光法證明其可與表達(dá)p185的腫瘤細(xì)胞靶向結(jié)合。
　　方法：
　　以pcDNA-H520C9scFv-hIL-2質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR獲得H5

2、20C9scFv片段,將此片段通過(guò)基因重組插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中。設(shè)計(jì)引物在H520C9scFv片段C端增加His6標(biāo)簽和凝血酶識(shí)別序列,再與質(zhì)粒pcDNA3.1(+)連接,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His6-H520C9scFv。對(duì)所得的重組基因進(jìn)行限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并測(cè)定目的序列。用LipofectamineLTXandPLUS將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Hi

3、s6-H520C9scFv轉(zhuǎn)染進(jìn)入293細(xì)胞,通過(guò)G418進(jìn)行篩選,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)His6-H520C9scFv的293細(xì)胞株。用RT-PCR、Westernblot檢測(cè)His6-H520C9scFv在293細(xì)胞中的表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)His6-H520C9scFv融合蛋白與表達(dá)p185的人乳腺癌細(xì)胞SK-Br3的特異結(jié)合。
　　結(jié)果：
　　成功擴(kuò)增出H520C9scFv片段;成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-His6-H52

4、0C9scFv;RT-PCR、Westernblot檢測(cè)到293細(xì)胞中His-H520C9scFv的表達(dá);免疫熒光法證明His6-H520C9scFv融合蛋白可與帶表達(dá)p185的人乳腺癌細(xì)胞SK-Br3的特異結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His6-H520C9scFv,并建立了穩(wěn)定表達(dá)His-H520C9scFv的293細(xì)胞株,證明了His-H520C9scFv融合蛋白可與HER2陽(yáng)性