部分銅綠假單胞菌臨床分離株中整合子的分布、耐藥性分析及其分子生物學特征.pdf

1、目的： 了解整合子在部分銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布及耐藥性情況，分析整合子與銅綠假單胞菌耐藥和多重耐藥的相關性。 了解整合子可變區(qū)攜帶的耐藥基因型，研究其分子生物學特征，探討整合子在細菌耐藥性產(chǎn)生和傳播擴散中的作用。 材料與方法： 1.菌株來源： 1997年至2003年問江蘇省人民醫(yī)院收集并隨機抽取的非重復性并具有臨床意義的銅綠假單胞茵菌株，共47株。 2.方法： 以煮沸法提取

2、47株銅綠假單胞菌的總DNA為模板，根據(jù)1、3類整合子各自整合酶基因保守區(qū)設計的引物，PCR擴增以篩選出各自陽性菌株；再將整合子陽性菌株與銅綠假單胞菌PU21共孵，行轉移接合試驗；采用瓊脂平皿稀釋法對47株菌株以及轉移接合子進行MIC測定，分析藥敏情況。 對1類整合子陽性菌株，根據(jù)1類整合子5’和3’保守區(qū)設計的通用可變區(qū)引物，PCR擴增其可變區(qū)。 將可變區(qū)PCR產(chǎn)物膠回收純化后，進行序列分析，結果與Genbank序列進

3、行比對，確定可變區(qū)所含耐藥基因盒。 以1類整合子陽性菌株與其對應接合子的總DNA為模板，根據(jù)1類整合子可變區(qū)測序結果設計所含耐藥基因盒對應的引物，PCR擴增每一個耐藥基因以確認克隆測序結果及初步檢驗整合子是否處于質粒上。 采用堿裂解法抽取整合子陽性菌株與其對應接合子的質粒。 采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析整合子陽性菌株的同源性。 結果：

4、 47株銅綠假單胞菌經(jīng)PCR法29株檢測到含有1類整合酶，占所有分離菌株的61.7％(29/47)，3類整合子未檢出。藥敏結果顯示1類整合子陽性菌株較陰性菌株耐藥率明顯升高；整合子陽性菌株對哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素的耐藥率最高，達到100％。29株1類整合子陽性菌株均轉移接合成功；轉移接合子與野生株比較，對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星均敏感，MIC90分別下降了8、128和128倍。

5、 29株攜帶的1類整合子可變區(qū)擴增產(chǎn)物均約為4.3kb。 序列分析結果表明：發(fā)現(xiàn)該可變區(qū)包含4個耐藥基因盒，形成一個新的組合形式aac(6’)-Ⅱ-aadA13-cmlA8-oxa-10，已提交Genbank，序列號為EU182575。其中aadA13首次在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)。同時第三個開放閱讀框的序列未見報道，與已知的cm1A5同源性最高為95％，將其命名為cm1A8。 無論野生株或接合子經(jīng)PCR均分別擴增出上述4個

6、耐藥基因盒，序列測定與克隆測序一致。 無論野生株或接合子均抽提出大小一致，大于10Kb的耐藥性質粒。 脈沖場凝膠電泳的分析結果顯示，所有1類整合子陽性菌株具有高度同源性，存在克隆傳播和可能相關關系。 結論： 本院銅綠假單胞菌臨床分離株中有1類整合子的流行。1類整合子陽性的菌株較陰性菌株對多種抗生素更容易產(chǎn)生耐藥。結合藥敏表型及整合子攜帶耐藥基因的基因型，整合子與銅綠假單胞茵耐藥和多重耐藥相關。和野生株相比