Gab1，EGFR，EGF基因多態(tài)性與肝外膽道癌的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、目的：
　　膽道上皮癌是起源于膽道上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，根據(jù)解剖位置的不同可分為肝內(nèi)膽道癌（肝癌膽管細(xì)胞型）、肝門部膽管癌、遠(yuǎn)端肝外膽管癌和膽囊癌。根據(jù)國際疾病分類法(ICD)，后三者又被統(tǒng)稱肝外膽道癌（簡稱膽道癌）。近年來，膽道癌的發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病率約為1-10/10萬。膽道癌是一種生存率極低的高致死性疾病，絕大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)腫瘤的一年之內(nèi)死亡，五年生存率僅為10-20％，其不良的預(yù)后源于沒有早期診斷和有效的治療手段。

2、r>　　膽道癌的病因尚未完全明了。同許多腫瘤一樣，目前認(rèn)為膽道癌是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果。研究表明，膽道癌發(fā)生有其遺傳易感性。
　　近年來，影響細(xì)胞增殖、凋亡途徑的信號分子的相關(guān)基因多態(tài)性與腫瘤易感性關(guān)系的研究成為腫瘤分子遺傳學(xué)研究中的新熱點(diǎn)。研究表明，受體酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號酶，至少31種RTK與人類的各種惡性腫瘤的發(fā)生

3、、發(fā)展和生存預(yù)后相關(guān)。
　　雖然RTK家族及其信號傳導(dǎo)通路下游分子的基因多肽在其他腫瘤領(lǐng)域已有研究，但在膽道癌方面卻仍鮮有報道，僅見個別關(guān)于肝內(nèi)膽道癌的研究。研究表明，肝內(nèi)膽道癌與肝外膽道癌在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和預(yù)后轉(zhuǎn)歸上存在諸多不同，而目前國內(nèi)和國際上尚無與RTK通路信號分子EGF, EGFR, Gab1相關(guān)的基因多態(tài)位點(diǎn)與肝外膽道癌的相關(guān)性研究報道。
　　本研究在我國漢族人群中開展此方面的探索，將有助于發(fā)現(xiàn)我國肝外膽道癌

4、新的易感基因，為探索肝外膽道癌的遺傳因素，最終闡明肝外膽道癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外，研究上述基因位點(diǎn)的多態(tài)性與肝外膽道癌分化程度及生存預(yù)后的相關(guān)性，以期探尋能反映膽道癌預(yù)后的新的遺傳性標(biāo)記物。
　　方法：
　　1.研究對象:
　　采用病例-對照分析方法，將所有研究對象分為三組:膽道癌組:選取自2008年1月-2010年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院住院并經(jīng)手術(shù)治療的肝外膽道癌患者225例（其中膽管癌153

5、例，膽囊癌72例）;膽石癥組:選取自2010年7月至2011年7月由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院收治的膽石癥患者300例，年齡和性別與膽道癌組相匹配。健康對照組:中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共300例。年齡和性別與膽道癌組相匹配，無血緣關(guān)系。所有研究對象均為遼寧漢族。
　　2.受試者相關(guān)臨床資料采集
　　通過采用問卷調(diào)查、體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測及住院病案整理及隨訪等方法收集研究對象的臨床資料，并記錄以下信息:年齡

6、、性別、籍貫、民族等基本信息;既往史和家族史;體重指數(shù)(BMI，kg/m2);是否吸煙（吸煙量和吸煙持續(xù)時間）、是否飲酒（飲酒量和飲酒持續(xù)時間）;是否罹患高血壓病及糖尿病;膽道癌組患者是否罹患膽道結(jié)石;膽道癌組患者術(shù)后病理結(jié)果（分化程度）、分期及預(yù)后情況（生存時間等）。
　　3.研究位點(diǎn)選擇
　　參閱文獻(xiàn)，查找美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI)及日本SNP數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)Itemational HapMaP Projec

7、t數(shù)據(jù)庫中CHB的基因組遺傳變異資料確定基因各SNP分布頻率。利用HaploView軟件中的Tag algorithm篩選標(biāo)簽SNP(Tag SNPs)。優(yōu)先選取位于蛋白編碼區(qū)可導(dǎo)致氨基酸序列改變、5'或3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)、啟動子區(qū)等具有潛在功能學(xué)意義的Gab1，EGFR，EGF基因多態(tài)作為研究位點(diǎn)。選取結(jié)果:將Gab1(rs3828512， rs3805236，rs300919， rs3805246);EGFR(rs1140475，rs20

8、17000，rs884419);EGF(rs4444903)作為研究位點(diǎn)。
　　4.實(shí)驗(yàn)方法
　　膽石癥組及健康對照組每個受試者采集2-3ml靜脈血，EDTA抗凝，應(yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒（北京艾德來生物公司）提取基因組DNA。膽道癌組采用石蠟組織DNA提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)進(jìn)行切片脫蠟并提取基因組DNA。將提取的人基因組DNA用紫外分光光度儀進(jìn)行純度鑒定和定量分析。最后對所

9、有研究對象的DNA應(yīng)用TaqMan SNP基因分型檢測技術(shù)(ABI7900)檢測上述位點(diǎn)的基因型。
　　5.統(tǒng)計學(xué)處理
　　將所有結(jié)果數(shù)字化錄入數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。連續(xù)性變量應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One-way ANOVA方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用x2擬合優(yōu)度檢驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡。在利用多變量logistic回歸分析校正年齡、性別以及膽道癌的其他危險因素的基礎(chǔ)上，采用四格表和R×C列

10、表x2檢驗(yàn)方法以及Fisher's exact test等方法分析膽道癌組及膽石癥組與對照組等位基因和基因型的頻率分布差異以及膽道癌組不同亞組、不同分化級別與SNPs各位點(diǎn)基因型頻率分布的關(guān)聯(lián)。應(yīng)用UNPHASED3.0.7(Frank Dudbridge，MRC Biostatistics UnitCambridge，UK)軟件，利用基因-基因相互作用(Gene-gene interaction，GGI)方法分析基因的聯(lián)合作用與膽道癌

11、的關(guān)系。采用卡普蘭-梅耶（Kaplan-Meier）法分析評估生存率曲線，用對數(shù)秩（Log-rank）檢驗(yàn)方法比較膽道癌組SNPs各位點(diǎn)不同基因型的患者生存率上的區(qū)別，并繪制生存曲線圖。采用Cox回歸方法，納入性別、年齡、既往膽石癥史、膽道癌分化級別及SNP基因型等多種因素后進(jìn)行生存影響因素分析。P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.所有研究對象的每個SNP位點(diǎn)的基因型在抽樣群體中的分布均符合Hardy

12、-Weinberg平衡(P＞0.05)，表示所選取的樣本具有人群代表性，適合做遺傳學(xué)分析。
　　2.膽道癌組、膽石癥與對照組一般資料比較:三組在年齡構(gòu)成、性別組成上無顯著性差異，在高血壓、糖尿病及飲酒史方面無顯著差異。在膽道癌人群中，既往有膽結(jié)石病史的患者比率明顯高于對照組(P＜0.05); BMI≥25以及有吸煙史的比率明顯高于對照組(P＜0.05)，說明膽石癥史、肥胖及吸煙與膽道癌的發(fā)生相關(guān)。在膽石癥人群中，BMI＜18.5的

13、比率明顯低于對照組(P＜0.05)，說明減輕體重可能對降低膽石癥的發(fā)病有益。
　　3.膽道癌組與對照組比較，在Gab1基因的rs3805246位點(diǎn)上，基因型頻率分布有統(tǒng)計學(xué)差異(x2值=5.015，P=0.025，OR=0.531，95％CI0.304-0.928）;在等位基因頻率比較中，膽道癌組與對照組也有統(tǒng)計學(xué)差異(x2值=6.157，P=0.013,OR=0.727,95％CI0.565-0.936)。
　　4.膽道癌

14、組與對照組比較，在EGFR基因的rs2107000位點(diǎn)上，基因型頻率分布有統(tǒng)計學(xué)差異:（x2值=7.934，P=0.005，OR=2.148，95％CI1.255-3.675）。在等位基因頻率比較中，膽道癌組與對照組也有統(tǒng)計學(xué)差異(x2值=6.278，P=0.012,OR=1.378,95％ CI1.072-1.771)。
　　5.膽道癌與對照組比較，在Gab1的rs3828512、rs3805236和rs300919位點(diǎn)，EGF

15、R的rs1140475和rs884419位點(diǎn)以及EGF的rs4444903位點(diǎn)的基因頻率分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，各位點(diǎn)的等位基因頻率分布也無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.膽石癥與對照組比較，在Gab1的rs3828512、 rs3805236、 rs300919和rs3805246位點(diǎn)，EGFR的rs1140475、rs2017000和rs884419位點(diǎn)以及EGF的rs4444903位點(diǎn)的基因頻率分布均無統(tǒng)計學(xué)

16、差異(P＞0.05)，上述各位點(diǎn)的等位基因頻率分布也無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.膽石癥史、肥胖(BMI≥25)及吸煙與膽道癌的發(fā)生相關(guān)，是膽道癌發(fā)病的危險因素。減輕體重可能對降低膽石癥的發(fā)病有益。
　　2.Gab1基因rs3805246位點(diǎn)A/A基因型可能是遼寧漢族人群膽道癌發(fā)病的獨(dú)立風(fēng)險因素，其風(fēng)險性主要來源于A等位基因。EGFR基因rs2017000位點(diǎn)G/G基因型可能是遼寧漢族人群膽道癌發(fā)病

17、的獨(dú)立的風(fēng)險因素，其風(fēng)險性主要來源于G等位基因。Gab1基因rs3805246位點(diǎn)A/A基因型和EGFR基因rs2017000基因G/G基因型聯(lián)合與膽道癌發(fā)病具有相關(guān)性;攜帶Gab1基因rs3805246位點(diǎn)A/A基因型和EGFR基因rs2017000基因G/G基因型的個體患膽道癌的風(fēng)險率較普通人群增加至1.620倍。未發(fā)現(xiàn)Gab1、EGFR及EGF的其它SNP位點(diǎn)與遼寧漢族人群的膽道癌發(fā)病相關(guān)。
　　3.膽道癌組及膽管癌、膽囊癌