小鼠KyoT家族的新異構(gòu)發(fā)現(xiàn)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、血管生成是多數(shù)情況下血管新生的重要方式——從創(chuàng)傷愈合到特定性生理周期(女性月經(jīng)周期),從多種人類(lèi)疾病的發(fā)生到腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,血管生成參與眾多重要生理性和病理性過(guò)程。
　　血管生成是由多步驟組成的復(fù)雜過(guò)程:首先細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)發(fā)生降解,接著血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)從已有血管中出芽,隨后ECs經(jīng)歷增殖、遷移、分化而形成血管,最后平滑肌細(xì)胞被募集至新生的血

2、管上。ECs不僅是構(gòu)成血管的重要組成部分,更是血管生成過(guò)程重要的“執(zhí)行者”。
　　近年來(lái)隨著體外血管生成體系的應(yīng)用、體內(nèi)基因剔除/敲入小鼠模型的建立,對(duì)血管生成機(jī)制的研究也不斷深入,發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)途徑在細(xì)胞、分子水平調(diào)控血管生成和ECs功能。Notch信號(hào)途徑因參與調(diào)控ECs的多種功能,決定ECs的命運(yùn),而成為備受關(guān)注的調(diào)控信號(hào)。
　　Notch信號(hào)途徑是進(jìn)化中高度保守的、通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸而激活的信號(hào)途徑,參與調(diào)控包

3、括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、命運(yùn)決定等多種重要過(guò)程。當(dāng)相鄰細(xì)胞間Notch配體與其受體接觸時(shí),Notch受體的胞內(nèi)段(Notch intracellular domain，NIC)就會(huì)釋放進(jìn)入細(xì)胞核,與核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白——重組信號(hào)結(jié)合蛋白-J(Recombination signal binding protein-Jκ，RBP-J)結(jié)合,從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。在缺少NIC的情況下,RBP-J則通過(guò)募集多種轉(zhuǎn)錄共抑制分子而發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的

4、作用。本室前期研究發(fā)現(xiàn):RBP-J可通過(guò)與LIM蛋白KyoT2結(jié)合而募集多種轉(zhuǎn)錄共抑制分子。但是，KyoT是由選擇性拼接形成的分子亞家族,與RBP-J結(jié)合的只有KyoT2嗎?是否還有其它KyoT分子能和RBP-J結(jié)合?這種結(jié)合對(duì)Notch信號(hào)途徑有什么樣的調(diào)控作用?對(duì)ECs的功能又有怎樣的影響?
　　基于上述設(shè)想,本課題發(fā)現(xiàn)了KyoT另一個(gè)剪接變異體KyoT3,深入研究了與RBP-J結(jié)合的LIM蛋白家族KyoT3的組織分布與細(xì)胞定

5、位,尋找其與RBP-J結(jié)合的直接證據(jù),闡明KyoT3對(duì)Notch信號(hào)途徑的調(diào)控作用,探究KyoT家族成員對(duì)ECs的功能的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.發(fā)現(xiàn)了KyoT家族的新異構(gòu)體。
　　首先,通過(guò)以小鼠胚胎cDNA文庫(kù)為模板,經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)獲得 KyoT家族另一剪接變異體,KyoT3。KyoT3,其全長(zhǎng)為969 bp,編碼包含323個(gè)氨基酸的大小為36.26

6、KD的蛋白質(zhì)。KyoT3的N-端是與KyoT1相同的3個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域,在LIM結(jié)構(gòu)域之后為KyoT1所不具備的3個(gè)核定位信號(hào)(Nuclear localization signals，NLS)和1個(gè)出核序列(Nuclear export sequence，NES)。與KyoT2相同的是:KyoT3也擁有由C-端27個(gè)氨基酸構(gòu)成的RBP-J結(jié)合基序,這提示KyoT3可能也具有與KyoT2相似的功能。利用位于KyoT3序列上的酶切位點(diǎn)Xh

7、oⅠ,將KyoT3分為前后2段,通過(guò)對(duì)2段分別擴(kuò)增后再拼接的方式,在不改變KyoT3序列、不引入新堿基的情況下,成功構(gòu)建pMD18-T-KyoT3,為進(jìn)一步研究KyoT3的功能打下基礎(chǔ)。
　　其次,探明了 KyoT3在組織中的分布和細(xì)胞內(nèi)的定位,并確認(rèn)其在細(xì)胞核內(nèi)的定位依賴(lài)于其 NLS。提取小鼠不同組織器官的RNA,經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄為cDNA之后,采用KyoT3特異性引物,通過(guò)PCR的方法研究KyoT3在組織內(nèi)的分布,發(fā)現(xiàn)KyoT3的m

8、RNA在小鼠脾臟、胸腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、心臟、大腦、胎盤(pán)、肺臟、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺都有表達(dá),說(shuō)明其組織分布十分廣泛。為明確 KyoT3在細(xì)胞內(nèi)的定位,構(gòu)建了含 KyoT3全長(zhǎng)的pEGFP-C2-KyoT3和pEGFP-N1-KyoT3;僅含NLS的pEGFP-C2-NLS和pEGFP-N1-NLS;不含有NLS的pEGFP-C2-KyoT3N和pEGFP-N1-KyoT3N質(zhì)粒。Western blot的方法發(fā)現(xiàn)其中C2-

9、KyoT3N的表達(dá)量很低后,通過(guò)其它5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,而確定了KyoT3主要分布于細(xì)胞核內(nèi),并且KyoT3在細(xì)胞核內(nèi)的定位是依賴(lài)于其3個(gè)串聯(lián)的NLS實(shí)現(xiàn)的。
　　最后,通過(guò)免疫共沉淀驗(yàn)證了KyoT3與RBP-J之間的相互作用,并進(jìn)一步明確了KyoT3具有抑制RBP-J依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄的作用。構(gòu)建了帶Myc標(biāo)簽的pCMV-Myc-KyoT3真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)與帶Flag標(biāo)簽的pCMV-RBP-J-Flag共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的方

10、式,采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),利用不同的抗體檢測(cè),確認(rèn)了KyoT3和RBP-J之間存在物理相互作用。隨即使用雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng),在HeLa細(xì)胞和HEK293細(xì)胞內(nèi)證實(shí)KyoT3具有抑制RBP-J依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄的作用,并且這種作用具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。此外,通過(guò)將KyoT3與NIC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,24 h后用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)下游基因Hes-1的mRNA水平的方法,結(jié)果也表明:共轉(zhuǎn)染KyoT3和NIC時(shí),KyoT3能顯著抑制NIC激活的H

11、es-1的轉(zhuǎn)錄。
　　2.闡明KyoT家族成員對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　首先,成功分離和培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs),在其中檢測(cè)到KyoT家族成員KyoT2的表達(dá)。為研究在血管生成中KyoT家族成員的作用,在本室建立了HUVECs的分離、培養(yǎng)的方法,并通過(guò)其形態(tài)表現(xiàn)為典型的鋪路石樣、表面CD31分子表達(dá)平均約為99％、具有形成管腔的能力,

12、對(duì)分離、培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了確認(rèn)。通過(guò)PCR的方法檢測(cè)HUVECs中KyoT家族成員的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在HUVECs中僅KyoT2表達(dá),于是將研究聚焦于KyoT2。
　　其次,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 KyoT2能使 HUVECs細(xì)胞系(HUVEC Cell line，HUVEC-CL)中管腔形成增多,tip細(xì)胞的數(shù)目增加,細(xì)胞增殖減少。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,使用脂質(zhì)體 LTXPLUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 EGFP-KyoT2于HUVECs和HUVEC-CL,通過(guò)計(jì)數(shù)

13、綠色細(xì)胞總數(shù)的方法,發(fā)現(xiàn):無(wú)論在 HUVECs或是HUVEC-CL中,與轉(zhuǎn)染EGFP的對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染KyoT2后細(xì)胞增殖減弱,然而轉(zhuǎn)染KyoT2卻能使HUVEC-CL中管腔形成增多,tip細(xì)胞的數(shù)目增加。
　　通過(guò)本課題的研究證實(shí):KyoT另一剪接變異體KyoT3的存在,并明確了其在組織中的分布和細(xì)胞內(nèi)的定位,并且 KyoT3在細(xì)胞核內(nèi)的定位是依賴(lài)于其3個(gè)串聯(lián)的NLS的。KyoT3能夠與RBP-J發(fā)生物理上的相互作用,也因此參與

14、了RBP-J介導(dǎo)的Notch信號(hào)途徑的調(diào)控。KyoT3能夠抑制RBP-J介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活,并且這種抑制作用具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。為研究KyoT家族成員在血管生成中的作用,在本室建立了 HUVECs的分離與培養(yǎng)方法,通過(guò)該方法能夠獲得純度高、功能好的HUVECs,作為研究ECs的模型。使用PCR的方法,檢測(cè)到僅KyoT2在HUVECs內(nèi)的表達(dá),因此也將研究重心轉(zhuǎn)移到KyoT2對(duì)ECs的功能影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KyoT2能夠抑制ECs增殖