SHH、E-cadherin和IL-6在慢性結石性膽囊炎組織中的表達及其意義.pdf

1、背景和目的:
　　 Sonic Hedgehog(SHH)分泌信號分子家族在早期胚胎發(fā)育、器官分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，通路的異常激活還與人類腫瘤的發(fā)生與演進密切相關。SHH蛋白是由SHH基因編碼的一種高度保守的分泌型糖蛋白。上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)是一類廣泛分布于胚胎和成熟組織上皮組織介導細胞間同質(zhì)粘附的鈣依賴性單次跨膜糖蛋白，是在生理條件下維持組織結構形態(tài)的完整性和細胞極性的重要成分。白細胞介素-6（int

2、erleukin-6）是細胞因子網(wǎng)絡中重要成分之一，亦是一種多功能的細胞因子，通過復雜的細胞信號傳導途徑，對細胞生長、分化、凋亡、轉化及免疫反應等過程都具有重要的調(diào)節(jié)作用。最近越來越多的研究顯示，SHH信號通路的異常激活和過度表達、E-cadherin表達減弱或缺失及IL-6的失調(diào)控參與多種腫瘤的發(fā)生過程，但SHH信號通路、E-cadherin和IL-6在炎癥疾病尤其是結石性膽囊炎組織中的作用在國內(nèi)尚無報道。本課題擬通過對慢性結石性膽囊

3、炎、膽囊癌組織標本中SHH、E-cadherin和IL-6表達水平的同步觀察，探討慢性結石性膽囊炎向膽囊癌發(fā)展轉化機制，目的旨在尋找膽囊癌特異性分子標志物，以利早期診斷及特異性靶向治療。
　　 材料和方法:
　　 1.膽囊炎標本的收集:選取廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2005年1月至2010年12月間經(jīng)病理確診、且術后病理蠟塊保存完好的慢性結石性膽囊炎患者術后的組織標本120例，其中男性48例，女性72例，平均年齡51.8歲。其中

4、輕度慢性結石性膽囊炎45例，中度慢性結石性膽囊炎45例，重度慢性結石性膽囊炎30例。對照組為囊腺癌患者術后組織標本（36例），男性20例，女性16例，平均年齡61.4歲，手術前均未放療或化療。
　　 2.常規(guī)HE染色判斷膽囊炎分級:60℃烤片30min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5min，共3次;蘇木素染色液染色5min;自來水沖洗去多余的染色液，約10min，蒸餾水洗滌;鹽酸酒精分化30s;自來水沖洗，

5、浸泡15min;伊紅染色液染色30s-2min（根據(jù)染色結果和要求調(diào)整時間）;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。慢性結石性膽囊炎分級標準:輕度:病程＜1年;B超提示膽囊壁輕度肥厚或無明顯的結節(jié)狀增厚現(xiàn)象;病理檢查顯示黏膜上皮保持完好.腺上皮細胞無異型性，炎細胞浸潤以淋巴細胞為主，有或無羅-阿氏竇下延，有腺體的輕度增生，黏液腺分泌增強。中度:介于輕度和重度之間。重度:病程＞5年;B超檢查提示有膽囊體積的萎縮或增大，有膽囊壁彌漫性或局

6、限性（結節(jié)狀）增厚，多伴有息肉樣病變;病理檢查顯示黏膜上皮部分或大部分脫失，未脫失的腺上皮細胞形成代償性區(qū)域性增生集中，增生的腺體有不規(guī)則的擴張，腺上皮細胞增生活躍。增厚的膽囊壁組織內(nèi)形成單個腺管及多個腺管的異型增生灶，炎細胞浸潤程度重，淋巴濾泡形成，纖維結締組織增生，多有羅-阿氏竇下延，黏液腺分泌增強。
　　 3.免疫組化法檢測組織標本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白表達:60℃烤片30min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫

7、水后，對組織抗原進行高溫熱修復;室溫下冷卻至常溫:磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5min，共3次，加3％過氧化氫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2min，共3次;滴加非免疫性動物血清阻斷非特異性結合，20min后甩去封閉液加一抗4℃保濕，過夜;PBS洗5min，共3次，滴加二抗，室溫孵育30min; PBS洗2min，共3次;DAB顯色，自來水終止反應并沖洗5min;蘇木素復染，清水沖洗;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性

8、樹膠封片。
　　 4.病理圖像分析定量檢測組織標本SHH、IL-6和E-cadherin蛋白含量:切片經(jīng)免疫組化染色完成后，每張切片隨機選取5個不同高倍視野(×400)進行拍照。免疫組織化學染色圖像分析檢測:在光鏡下觀察指標:免疫復合物沉積部位及免疫反應強度的觀察。陽性判斷標準:當細胞膜和（或）胞漿出現(xiàn)棕黃色陽性物質(zhì)作為陽性細胞。觀察參數(shù):慢性結石性膽囊炎和膽囊癌組織中E-cadherin和IL-6表達的陽性顆粒的參數(shù)值——平均

9、灰度、陽性單位。圖像分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:在400倍視野下，每張玻片選取5個視野，采用武漢千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖片報告分析系統(tǒng)測定陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值。
　　 5.統(tǒng)計學分析:運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。膽囊炎、膽囊癌組織SHH、IL-6、E-cad蛋白表達的陽性單位、平均灰度值以x±s表示，采用單因素方差分析進行了完全隨機設計的方差分析（方差齊時采用Fisher法，其中兩兩比較采用L

10、SD法;方差不齊時采用Welch法，其中兩兩比較采用Dunnett T3法）及Pearson相關分析，以F為統(tǒng)計量，以雙側a=0.05作為檢驗水準，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.SHH的表達與各臨床病理指標之間的關系:SHH主要在膽囊黏膜上皮細胞和膽囊癌細胞的胞膜上和胞漿內(nèi)表達。慢性輕、中、重度結石性膽囊炎及對照組（膽囊癌組）組織標本中SHH陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計學意義(P＜0.

11、01)，表現(xiàn)出隨慢性結石性膽囊炎由輕到重的不同病理損傷程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性上升趨勢，對照組（膽囊癌組）最高。SHH蛋白表達與性別、年齡等因素均無關(P＞0.05)，SHH蛋白表達與結石大小(直徑＞3cm或≤3cm)具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2.E-cadherin的表達與各臨床病理指標之間的關系:E-cadherin主要在膽囊黏膜上皮細胞和膽囊癌細胞的胞膜上和胞漿內(nèi)表達。慢性輕、中、重度結石

12、性膽囊炎及對照組（膽囊癌組）組織標本中E-cadherin陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表現(xiàn)出隨慢性結石性膽囊炎由輕到重的嚴重程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性下降趨勢，對照組（膽囊癌組）最低。E-cadherin蛋白表達與性別、年齡等因素均無關（P＞0.05），E-cadherin蛋白表達與結石大小(直徑＞3cm或≤3cm)具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3.IL-6的表達與各臨

13、床病理指標之間的關系:IL-6主要在膽囊黏膜上皮下間質(zhì)、膽囊黏膜上皮細胞胞漿和膽囊癌細胞的胞漿內(nèi)表達（圖4）。慢性輕、中、重度結石性膽囊炎及對照組（膽囊癌組）組織標本中IL-6陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表現(xiàn)出隨慢性結石性膽囊炎由輕到重的不同病理損傷程度而陽性顆粒的平均灰度和陽性單位值呈顯著性上升趨勢，對照組（膽囊癌組）最高（表1）。IL-6表達與性別、年齡等因素均無關(P＞0.05)，IL-6表達與結石

14、大?。ㄖ睆剑?cm或≤3cm）具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.SHH、E-cadherin和IL-6蛋白在慢性結石性膽囊炎組織中表達的相關性分析:配對資料的Pearson相關分析顯示，SHH表達與E-cadherin表達呈負相關關系（r平均灰度=-0.71，r陽性單位=-0.68，P＜0.01），SHH表達隨E-cadherin表達上升而表現(xiàn)出下降趨勢。IL-6表達與E-cadherin表達呈負相關關系（r平均灰度=

15、-0.75，r陽性單位=-0.83，P＜0.01），IL-6表達隨E-cadherin表達上升而表現(xiàn)出下降趨勢。SHH表達與IL-6表達呈正相關關系（r平均灰度=0.71，r陽性單位=0.88，P＜0.01），SHH表達隨IL-6表達上升亦表現(xiàn)出上升趨勢。
　　 結論:
　　 本實驗結果顯示SHH、E-cadherin和IL-6表達與慢性結石性膽囊炎病情的嚴重程度及膽囊結石的大小有關，與病人年齡、性別等因素均無關。研究通

16、過Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)，SHH和IL-6表達存在正相關關系，SHH、IL-6與E-cadherin表達分別呈負相關關系。我們的結果提示，在慢性結石性膽囊炎組織中，SHH信號通路異常激活可能引起膽囊上皮細胞的過度增殖和惡變，E-cadherin作為一種抑癌基因，其表達下調(diào)可能導致膽囊上皮細胞骨架破壞與極性喪失，IL-6的長期表達上調(diào)可能引起膽囊上皮細胞的過度增殖，并且三者存在一定相關性。有研究表明，E-cadherin表達下調(diào)參與激

17、活SHH信號通路，SHH通路中轉錄因子Glil能活化E-cadherin的抑制物Snail，現(xiàn)已明確Snail作為轉錄抑制因子，可直接與E-cadherin的啟動子E-boxes結合，從而抑制E-cadherin轉錄，導致E-cadherin表達下調(diào)進而介導上皮細胞骨架破壞、轉移和侵襲能力增強。組織炎癥反應過程中，表達上調(diào)的IL-6可激活核轉錄因子KB(NF-KB)，而活化的NFKB可進入細胞核內(nèi)引起轉錄因子Snail表達上調(diào)以介導上皮

18、細胞骨架破壞。因此我們推測，作為誘發(fā)慢性膽囊炎最主要原因之一的膽囊結石長期機械損傷導致膽囊黏膜上皮細胞骨架破壞，極性喪失和E-cadherin表達下調(diào)，進而通過激活SHH信號通路引起膽囊上皮細胞過度增殖，同時活化的SHH通路通過活化Snail進而抑制E-cadherin的表達。慢性炎癥導致細胞因子IL-6過表達，進而誘導膽囊黏膜上皮細胞過度增殖。IL-6亦通過激活NF-KB誘導E-cadherin表達下調(diào)，使上皮細胞骨架破壞、極性喪失進