電針預(yù)處理改善心肌缺血性損傷的β-,1--腎上腺素能受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、心肌缺血性疾病是世界范圍內(nèi)死亡率最高的疾病之一。過去的臨床和實(shí)驗(yàn)工作表明，針刺可以改善心肌缺血引起的心電圖ST段的改變，緩解心絞痛。但由于心肌缺血性疾病(如冠心病等)發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率較高，一般急性發(fā)作病人很少來針灸科治療，使得針灸在該病的治療上難以發(fā)揮作用。然而，過去有關(guān)針灸方面的研究工作卻提示，針灸可能對(duì)于冠心病、心肌缺血具有未病先防的作用，即，預(yù)防或減輕冠心病的發(fā)病。因此，探討一條合適的途徑來發(fā)揮針刺在防治冠心病心肌缺血性損害的作用

2、具有重要的臨床意義和科學(xué)價(jià)值。 大量研究證實(shí)：心肌缺血性損害可以引發(fā)心臟交感神經(jīng)過度興奮以及心臟對(duì)交感神經(jīng)興奮性調(diào)節(jié)的反應(yīng)性增強(qiáng)。繼而引起β1-腎上腺素能受體(β1-AR)過度興奮，經(jīng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載等因素有關(guān)。而適當(dāng)提高交感神經(jīng)興奮性對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用，如采用心臟腎上腺素能受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分激動(dòng)劑預(yù)處理方法，可以改善其后較長時(shí)間的心肌缺血導(dǎo)致的心肌損傷。而過去有關(guān)針灸方面的研究工作顯示，針刺可

3、直接提高交感神經(jīng)的興奮性。因此，針刺極有可能通過影響交感神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而作用于心臟β1-AR及其受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而象受體激動(dòng)劑預(yù)處理一樣，起到改善缺血性心肌損害的作用。然而，迄今這方面的研究工作尚未見報(bào)道。 本項(xiàng)研究采用結(jié)扎和再灌大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法建立實(shí)驗(yàn)性心肌局部缺血模型和離體心臟模擬全心缺血(低灌流)模型，探討電針預(yù)處理對(duì)心肌缺血性損傷的保護(hù)作用，并深入闡明β1-AR及其受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑在介導(dǎo)電針預(yù)處理改善缺

4、血性心肌損害中的作用。為針刺預(yù)防冠心病、心肌缺血及針刺的“治未病”的保健作用提供現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)選用雄性成年Wister大鼠120只，體重278±25g；雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重255±17g。第一部分實(shí)驗(yàn)中將大鼠隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組(NC組)、缺血再灌注組(IR組)、缺血再灌注+電針組(EA組)和缺血再灌注+電針+心得安組(EAP組)。EA組于每次麻醉后電針內(nèi)關(guān)30min(電針參數(shù)：

5、強(qiáng)度5mA，頻率20Hz)，連續(xù)三天；EAP組于每次麻醉后先腹腔注射心得安(10mg/kg)，15min后再電針內(nèi)關(guān)30min，連續(xù)三天。NC組、IR組僅于每次麻醉后捆綁30min，不做其他處理，連續(xù)三天。第二部分實(shí)驗(yàn)中將大鼠隨機(jī)分為三組：NC組、IR組和EA組，各組預(yù)處理方法同前。 實(shí)驗(yàn)共分兩部分進(jìn)行：第一部分實(shí)驗(yàn)通過觀察心電圖ST段變化、心律失常評(píng)分、心肌梗塞范圍測(cè)定、分離的心肌細(xì)胞存活率以及異丙腎上腺素(Isoproter

6、enol，ISO)作用下單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩([Ca2+]ioscillation)情況等指標(biāo)來確定電針預(yù)處理的保護(hù)作用。第二部分實(shí)驗(yàn)通過觀察β1-AR蛋白、Gsα蛋白、cAMP的變化，以及Forskolin(腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑)、8-Br-cAMP(蛋白激酶A的激動(dòng)劑)、BayK-8644(L-型Ca2+通道的激動(dòng)劑)等β1-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分激動(dòng)劑的作用下，單個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+變化情況，探討β1-AR及其受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上

7、哪一或哪些信號(hào)分子參與介導(dǎo)電針預(yù)處理改善心肌缺血的保護(hù)作用。具體結(jié)果如下： 1.電針預(yù)處理改善心肌缺血性損傷療效的確定1)心電圖(ECG)ST段變化：結(jié)扎前NC，IR，EA和EAP組分別為：42.80±8.43，43.35±10.78，35.97±4.62和44.88±11.58μV，缺血期各組動(dòng)物(NC組除外)的ST段均呈進(jìn)行性抬高，至結(jié)扎30min到達(dá)峰值，IR，EA，EAP組分別為162.50±30.24，103.00±1

8、5.98和142.38±24.39μV，與正常組43.50±9.67μV比較，IR組ST段顯著抬高(P＜0.01)，而與IR組比較，EA組ST段抬高幅度明顯降低(P＜0.01)；各組再灌注10min后三組ST段均有不同程度的回落，IR組為：110.50±23.82μV，明顯高于正常組44.19±10.55μV(P＜0.01)，僅有EA組逐步恢復(fù)至結(jié)扎前水平，為50.81±10.27μV，與IR組比較其抬高幅度明顯降低(P＜0.01)；而

9、EAP組于結(jié)扎30min142.38±24.39μV和再灌注10min93.19±19.21μV，其抬高幅度與IR組很接近，均明顯高于EA組(P值均＜0.01)。 2)心律失常評(píng)分：IR組評(píng)分為3.17±1.17，明顯高于NC組(P＜0.01)；EA組評(píng)分為1.10±0.99，明顯低于IR組(P＜0.01)；EAP組心律失常評(píng)分為2.97±0.99，明顯高于EA組(P＜0.01)。 3)梗塞范圍測(cè)定：IR組梗塞范圍為38

10、.63±2.92﹪，EA組為21.51±1.73﹪，明顯低于與IR組(P＜0.01)；而EAP組為36.62±3.70﹪，與IR組很接近，而明顯高于EA組(P＜0.01)。4)心肌細(xì)胞存活率：NC組心肌細(xì)胞存活率為73.53±0.86﹪；而IR組存活率為22.80±0.78﹪，明顯低于NC組(P＜0.01)；EA組為71.62±0.46﹪，明顯高于IR組(P＜0.01)；而EAP組為24.41±0.67﹪，明顯高于EA組(P＜0.01)

11、 5)Isoproterenol(ISO)誘發(fā)的鈣振蕩：IR組心肌細(xì)胞在加入ISO(1×10-6mol/L)后出現(xiàn)了頻繁的鈣振蕩；EA組心肌細(xì)胞在ISO作用下鈣振蕩的發(fā)生明顯降低；而EAP組心肌細(xì)胞卻在加入ISO后亦出現(xiàn)了頻繁的鈣振蕩。 2.探討β1-AR及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在電針預(yù)處理改善心肌缺血性損傷中的介導(dǎo)作用1)β1-AR蛋白變化：IR組β1-AR蛋白與NC組比較增加了40.78﹪(P＜0.01)，而EA組增加了11

12、.93﹪，明顯低于IR組(P＜0.01)。 2)Gsα蛋白變化：IR組Gsα-S和Gsα-L蛋白與NC組比較分別增加了37.86﹪(P＜0.01)和25.58﹪(P＜0.01)，而EA組僅分別增加了0.59﹪和1.92﹪，但均明顯低于IR組(P＜0.01和P＜0.05)。 3)Forskolin作用下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細(xì)胞在Forskolin(5×10-7mol/L)激動(dòng)下鈣瞬變的波幅與Control相

13、比較增加了157.87﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的NC組增加的幅度(77.07﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細(xì)胞在Forskolin作用下鈣瞬變的增加的幅度為78.41﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的IR組比較增加幅度明顯降低(P＜0.01)。 4)心肌組織cAMP含量：NC組為0.36±0.07pmol/mL，而IR組為0.62±0.09pmol/mL，明顯高于NC組(P＜0.01)，EA組為0.36±0.05

14、pmol/mL，其含量明顯低于與IR組(P＜0.01)。 5)8-Br-cAMP作用下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細(xì)胞在8-Br-cAMP(1×10-6mol/L)激動(dòng)下鈣瞬變的波幅與Control相比較增加了68.92﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的NC組增加的幅度(54.15﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細(xì)胞在8-Br-cAMP作用下鈣瞬變的增加的幅度為57.36﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的IR組比較

15、增加幅度明顯降低(P＜0.05)。 6)BayK-8644作用下心肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變情況：IR組缺血心肌細(xì)胞在BayK-8644(5×10-7mol/L)激動(dòng)下鈣瞬變的波幅與Control相比較增加了78.02﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的NC組增加的幅度(59.06﹪)比較明顯增高(P＜0.01)，而EA組缺血心肌細(xì)胞在BayK-8644作用下鈣瞬變的增加的幅度為62.17﹪(P＜0.01)，與相應(yīng)的IR組比較增加幅度明顯降低(P＜

16、0.01)。 結(jié)論大鼠局部心肌缺血可造成ST段的過度抬高、心律失常發(fā)生率及心肌梗塞面積的異常增加；模擬全心缺血后，心肌細(xì)胞的存活率大大降低、并且導(dǎo)致ISO誘導(dǎo)的鈣振蕩現(xiàn)象頻發(fā)。由本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果提示其損害機(jī)制表現(xiàn)為：缺血心肌細(xì)胞膜內(nèi)β1-AR蛋白水平的異常增高，從而沿其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑引起Gsα蛋白水平和缺血心肌組織cAMP含量的過度增高，并導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)Forskolin(AC激動(dòng)劑)、8-Br-cAMP(PKA激動(dòng)劑)和BayK-

17、8644(L-型Ca2+通道激動(dòng)劑)作用下引起的細(xì)胞內(nèi)游離鈣變化的反應(yīng)性均明顯增強(qiáng)等一系列變化?？梢姦?-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)各個(gè)站點(diǎn)：β1-AR、Gsα、AC、cAMP、PKA和L-型Ca2+通道都參與介導(dǎo)了心肌缺血誘導(dǎo)的心肌損害和心臟功能障礙。 電針預(yù)處理可以有效地減低大鼠心肌缺血所引起的ST段的抬高；降低心肌梗塞面積；提高缺血心肌細(xì)胞的存活率；減少缺血性心臟心律失常的發(fā)生率；抑制缺血心肌細(xì)胞由ISO誘導(dǎo)的鈣振蕩，對(duì)隨后的心肌缺