Smad3-microRNA-21介導(dǎo)阿托伐他汀的促血管新生作用.pdf

1、背景：他汀類藥物具有不依賴于降脂作用的多方面心血管保護(hù)作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)多種他汀類藥物具有促進(jìn)缺血性血管新生作用，并且揭示這一作用與激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號(hào)有關(guān)。然而他汀類藥物促進(jìn)血管新生的上游機(jī)制目前仍未完全闡明。
　　 MicroRNA-21(miR-21)是一種非編碼的小RNA，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)各種生物功能。近來(lái)研究提示miR-21可能具有促進(jìn)血管新生的作用。已有研究證實(shí)10號(hào)染色體q23有

2、缺失且與張力蛋白同源的磷酸酯酶基因(PTEN)為miR-21的靶基因，而PTEN可抑制Akt的激活。因此，miR-21可能通過(guò)PTEN/Akt信號(hào)途徑促進(jìn)血管新生。臨床資料顯示他汀藥物可以影響內(nèi)皮祖細(xì)胞中microRNA(miRNA)的表達(dá)。因此，我們推測(cè)他汀類藥物的促血管新生作用可能與其影響miR-21水平有關(guān)。
　　 Smad3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)/Smads信號(hào)途徑中受體活化型蛋白之一，參與細(xì)胞的增殖及分化等過(guò)程。

3、已有研究提示Smad3在促進(jìn)血管新生中可能起重要作用，而其它研究卻發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可影響Smad蛋白的表達(dá)。因此我們推測(cè)他汀類藥物的促血管新生作用可能與其影響Smad3蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 近來(lái)研究資料表明Smad3在促進(jìn)miR-21的生物合成中起重要調(diào)控作用。因此，他汀類藥物有可能通過(guò)促進(jìn)Smad3蛋白表達(dá)，進(jìn)一步增加miR-21的生物合成而發(fā)揮其促血管新生作用。
　　 目的：觀察阿托伐他汀對(duì)缺血肌肉組織以及體外培養(yǎng)的人

4、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Smad3及miR-21表達(dá)的影響以及對(duì)血管新生的促進(jìn)作用；探討Smad3/miR-21在阿托伐他汀的促進(jìn)血管新生中的作用。
　　 方法：
　　 1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：20只后肢缺血ICR小鼠被隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組及阿托伐他汀處理組(每組10只)。下肢動(dòng)脈離斷術(shù)后次日起阿托伐他汀組每日胃飼給予阿托伐他汀5 mg/kg，對(duì)照組給予等體積生理鹽水溶液，共4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收取缺血后肢肌肉標(biāo)本，提取組織蛋白行Wester

5、n Blot法檢測(cè)Smad3蛋白表達(dá)水平；提取RNA行螢光定量Real-time PCR(Q-PCR)法檢測(cè)缺血組織中miR-21變化以及免疫組化法計(jì)數(shù)缺血組織中毛細(xì)血管數(shù)目。
　　 2.體外實(shí)驗(yàn)：不同濃度的阿托伐他汀(Control，0.0001μM，0.001μM及0.1μM)與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)孵育48小時(shí)。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中Smad3、PTEN及磷酸化的Akt(p-Akt)水平；Q-PCR法

6、檢測(cè)細(xì)胞中miR-21表達(dá)；In Vitro Angiogenesis Assay檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
　　 3.MiR-21干擾抑制實(shí)驗(yàn)：用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將不同濃度的miR-21抑制劑(分別為10 nM、30 nM、50 nM及100 nM)轉(zhuǎn)染HUVEC，然后與0.1uM的阿托伐他汀共孵育48小時(shí)。WesternBlot法檢測(cè)細(xì)胞中PTEN及p-Akt的蛋白表達(dá)水平；Q-PCR法檢測(cè)HUVEC中m

7、iR-21和PTEN表達(dá)情況；In Vitro Angiogenesis Assay檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
　　 4.MiR-21過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)：用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將30 nM及50 nM的miR-21模擬物分別轉(zhuǎn)染HUVEC，然后與0.1uM的阿托伐他汀共孵育48小時(shí)。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中PTEN及p-Akt的蛋白表達(dá)水平；Q-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-21和PTEN表達(dá)；In VitroA

8、ngiogenesis Assay檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度。
　　 5.Smad3-siRNA干擾抑制實(shí)驗(yàn)：用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將60 nM的Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC，然后與0.1 uM的阿托伐他汀共孵育48小時(shí)。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中Smad3、PTEN及p-Akt的蛋白表達(dá)水平；Q-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-21表達(dá)；In VitroAngiogenesis Assay檢測(cè)管樣結(jié)構(gòu)

9、長(zhǎng)度。
　　 結(jié)果：
　　 1.給予阿托伐他汀喂食小鼠4周后，后肢缺血肌肉組織中Smad3蛋白以及miR-21表達(dá)明顯增加，同時(shí)缺血組織毛細(xì)血管數(shù)目明顯增多(所有P<0.01)。
　　 2.HUVEC中Smad3、p-Akt蛋白以及miR-21表達(dá)隨著阿托伐他汀濃度(0.0001 uM，0.001 uM及0.1 uM)的升高而呈濃度依賴性增加，同時(shí)HUVEC形成管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度明顯增加；而PTEN蛋白表達(dá)水平明顯

10、降低(所有P<0.01)。
　　 3.MiR-21抑制劑(10 nM、30 nM、50 nM及100 nM)呈濃度依賴性明顯下調(diào)0.1 uM阿托伐他汀孵育的HUVEC中p-Akt蛋白及miR-21的表達(dá)，同時(shí)減少了HUVEC形成管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度；然而上調(diào)了HUVEC中PTEN蛋白的表達(dá)(所有P<0.01)，而對(duì)PTENmRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(所有P>0.05)。
　　 4.MiR-21模擬物(30 nM及50 nM)明顯

11、上調(diào)0.1 uM阿托伐他汀孵育的HUVEC中p-Akt蛋白及miR-21的表達(dá)，同時(shí)增加HUVEC形成管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度；然而明顯下調(diào)HUVEC中PTEN蛋白的表達(dá)(所有P<0.01)而對(duì)PTEN mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(均P>0.05)。
　　 5.Smad3-siRNA轉(zhuǎn)染后HUVEC中Smad3、磷酸化的Akt蛋白以及miR-21表達(dá)明顯下降，同時(shí)HUVEC形成管樣結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度明顯減少；而HUVEC中PTEN蛋白表達(dá)卻明顯增

12、加(所有P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.阿托伐他汀有促進(jìn)缺血肌肉組織中Smad3蛋白及miR-21的表達(dá)以及血管新生作用；阿托伐他汀有促進(jìn)HUVEC中Smad3、p-Akt蛋白及miR-21的表達(dá)以及血管新生作用，同時(shí)抑制了PTEN蛋白的表達(dá)。
　　 2.MiR-21介導(dǎo)了阿托伐他汀誘導(dǎo)的HUVEC的血管新生作用。
　　 3.Smad3/miR-21介導(dǎo)了阿托伐他汀誘導(dǎo)的HUVEC的血管新生作用