TOP2A在胃癌中的表達及TOP2A低表達胃腺癌細胞模型的建立.pdf

1、[目的]由于拓撲異構(gòu)酶IIα(Topoisomerase IIα)基因TOP2A在染色體分離、配對、濃縮、結(jié)構(gòu)形成及改變DNA超螺旋結(jié)構(gòu)有重要的作用，并且又是很多腫瘤化療藥物的作用靶點，因此它在腫瘤治療中引起了特殊的關注。我科基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織中的TOP2A明顯高表達，本課題擬通過病例調(diào)查，明確TOP2A在人胃癌組織中的表達特征，并進一步建立TOP2A基因低表達的胃腺癌細胞模型，明確抑制TOP2A蛋白表達對其生物學行為的影響，為

2、將來探討TOP2A蛋白表達對topoII抑制劑的療效的預測作用提供良好的基礎。
　　 [方法]本研究共分兩部分：
　　 第一部分，首先從2004年-2008年從本院就診的胃癌患者中篩選出做TOP2A蛋白免疫組化染色患者200例，根據(jù)其TOP2A蛋白表達量的高低及分化程度、病變部位分組進行統(tǒng)計分析；其次，用WesternBloting(WB)法檢驗胃癌細胞株MGC-803、BGC-823及乳腺癌細胞株MCF-7中TOP2A

3、蛋白的表達。
　　 第二部分，設計構(gòu)建針對TOP2A基因的shRNA(smallhairpin RNA，短發(fā)夾RNA)重組表達質(zhì)粒pSRZTop IIα并轉(zhuǎn)染至G3T-hi包裝細胞，收集綠色熒光蛋白表達陽性的包裝細胞病毒上清，測定病毒滴度，感染三株目的細胞BGC-823、MGC-803及MCF-7，流式分選陽性克隆，擴增并培養(yǎng)。WB檢測三株目的細胞感染重組逆轉(zhuǎn)錄病毒pSRZTop IIα后細胞內(nèi)TOP2A的表達情況，并用細胞生長

4、曲線的方法記錄感染病毒前后細胞生長狀態(tài)及活性的變化。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分，200例TOP2A蛋白表達陽性患者其表達量的高低與患者年齡、性別、胃癌分化程度及胃癌部位并無相關性；胃腺癌細胞BGC-823、MGC-803和乳腺癌細胞MCF-7的總蛋白進行Western bloting檢測，均有TOP2A的表達。
　　 第二部分，酶切及測序鑒定pSRZTop IIα質(zhì)粒構(gòu)建成功，pSRZTop IIα表達質(zhì)粒

5、轉(zhuǎn)染至G3T-hi包裝細胞后收集病毒上清，病毒滴度測定結(jié)果最高達1.87×107，由此證實逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建成功；目的細胞感染病毒并分選后進行熒光顯微鏡觀察，64h的熒光蛋白表達比率較17h明顯增高，證實逆轉(zhuǎn)錄病毒感染目的細胞成功，三株目的細胞感染后TOP2A蛋白表達較陰性對照組明顯降低，胃腺癌細胞MGC-803細胞生長趨勢較未感染組和陰性對照組明顯減慢，各時間點細胞計數(shù)值明顯降低。
　　 [結(jié)論]1.靶向TOP2A的shRNA能瞬