胰島素對不穩(wěn)定斑塊形成的影響及機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　急性冠狀動脈綜合征(Acutecoronarysyndrome,ACS)是冠心病中致死率最高的臨床類型。眾多研究表明,決定ACS發(fā)生的關鍵因素是冠狀動脈內斑塊的穩(wěn)定性,所以不穩(wěn)定斑塊(unstableplaque)是ACS的關鍵病理基礎,不穩(wěn)定斑塊發(fā)生糜爛或破裂,誘發(fā)急性血栓形成,最終導致惡性心血管事件發(fā)生。深入研究不穩(wěn)定斑塊的形成以及破裂對臨床防治ACS,減少死亡率至關重要。但斑塊―不穩(wěn)定性‖機制尚不清楚。

2、>　　近年研究表明,炎癥反應可以改變動物粥樣硬化斑塊的結構,參與動脈粥樣硬化斑塊的破裂,針對介導炎癥反應的重要信號通路進行有效干預是阻止不穩(wěn)定斑塊形成的重要環(huán)節(jié)。而Toll樣受體4(TLR4)信號介導的炎癥反應是與粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關的重要分子機制,如何調控TLR4介導的炎癥反應是穩(wěn)定斑塊、減少ACS發(fā)生的關鍵。胰島素一直被認為是調節(jié)糖代謝的重要激素,但近年來,越來越多的證據表明:胰島素具有多重作用,除了調節(jié)血糖代謝外,還可以通過

3、PI3K-AKT通路抑制炎癥反應。聯系以往研究,在機體TLR-NF-κB信號通路被激活,炎癥反應不斷發(fā)展的過程中,PI3K-AKT通路活性受到抑制,但是加強PI3K-AKT通路活性受是否可以影響TLR-NF-κB信號通路則尚未見報道?；谝陨衔覀冊O計并完成了相關實驗。
　　研究目的:
　　1.建立ApoE基因缺陷小鼠(ApoE-/-mice)不穩(wěn)定斑塊模型,觀察胰島素對斑塊形成的影響;
　　2.建立泡沫細胞模型模擬動脈

4、粥樣硬化斑塊形成,觀察胰島素對泡沫細胞形成的影響;
　　3.探討胰島素對泡沫細胞形成影響的機制,特別是對TLR4介導的炎癥反應的影響。
　　實驗方法:
　　1.40只6-8WApoE‐/‐小鼠高脂喂養(yǎng)1W后,隨機分為對照組和手術組。手術組小鼠行右側頸總動脈套管術,術后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8W。8W末隨機取手術組小鼠,過量麻醉處死,HE觀察小鼠頸動脈斑塊形成情況。
　　2.確認斑塊形成后,將手術組小鼠隨機分為兩組:手術組和

5、胰島素組。胰島素組給予胰島素皮下注射2W,手術組則用生理鹽水代替。2W后,過量麻醉劑處死小鼠,ELISA法測小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌,HE染色觀察頸動脈斑塊形態(tài),油紅O染色觀察斑塊內脂質聚集,巨噬細胞免疫組化觀察斑塊內巨噬細胞聚集。
　　3.體外培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7,建立巨噬細胞泡沫細胞模型。隨機分為5組:(1)對照組;(2)ox-LDL組;(3)ox-LDL+insulin組;(4)ox-LDL+ins

6、ulin+wortmannin組;(5)ox-LDL+wortmannin組。油紅O染色觀察細胞內脂質聚集情況,ELISA法測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6分泌,TUNEL法測巨噬細胞凋亡,real-timePCR法測TLR4、MMP9的mRNA轉錄情況,westernblot法測TLR4、Myd88、NF-κB蛋白表達。
　　實驗結果:
　　1.ApoE‐/‐小鼠通過PCCP手術高脂喂養(yǎng)8W后,HE染色結果顯示:手術

7、組小鼠頸動脈內出現動脈粥樣硬化斑塊,其內部脂質池較大,而對照組小鼠頸動脈管壁光滑,無斑塊形成,建模成功。
　　2.胰島素注射2W后,三組小鼠的TC、TG、以及LDL無顯著差異。ELISA測外周血炎性因子TNF-α與IL-6顯示:手術組與對照組炎性因子無差異;與手術組比較,胰島素組血清炎性因子含量減少,有顯著差異(P<0.05)。HE染色結果顯示:與手術組相比,胰島素組頸動脈腔內的斑塊脂質池減少,斑塊結構較為穩(wěn)定;油紅O染色結果顯示

8、:與手術組相比,胰島素組斑塊內脂質含量顯著降低(P<0.05);巨噬細胞免疫組化染色顯示:胰島素組較手術組巨噬細胞含量顯著降低(P<0.05)。
　　3.油紅O染色與TUNEL結果顯示:50mg/L的ox-LDL可以成功誘導巨噬細胞泡沫化,巨噬細胞內有大量紅色脂滴顆粒存在,且促進巨噬細胞凋亡(P<0.01vs對照組),而胰島素干預后可以顯著抑制巨噬細胞對ox-LDL的吞噬,細胞內紅色脂滴顆粒顯著減少,巨噬細胞凋亡減少(P<0.01

9、vsox-LDL),而應用PI3K抑制劑抑制胰島素PI3K信號通路后胰島素的作用被顯著減弱(P<0.01vsox-LDL+insulin)。
　　4.ox-LDL干預細胞后,細胞培養(yǎng)液中炎性因子TNF-α與IL-6分泌顯著增加(P<0.01);TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表達水平上調(P<0.05vs對照組),同時與對照組相比,MMP9的mRNA水平也顯著增高(P<0.01)。胰島素干預后,培養(yǎng)液中的炎性因子T

10、NF-α與IL-6分泌顯著下降(P<0.01vsox-LDL),TLR4、Myd88、NF-κB的mRNA和蛋白表達水平顯著下調(P<0.05vsox-LDL),同時MMP9的mRNA水平也顯著降低(P<0.01vsox-LDL)。PI3K抑制劑抑制胰島素PI3K信號通路后,胰島素的抑制作用被顯著減弱,TNF-α與IL-6分泌顯著增加(P<0.01vsox-LDL+insulin),TLR4、Myd88、NF-κB、MMP9的mRNA和

11、蛋白水平也顯著增加(P<0.05vsox-LDL+insulin)。
　　結論:
　　1.成功建立了ApoE-/-小鼠不穩(wěn)定性較高的動脈粥樣斑塊模型,胰島素干預可以有效降低小鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量,降低小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性;
　　2.胰島素可以抑制巨噬細胞的泡沫化,抑制由于ox-LDL誘導引起的炎性因子TNF-α、IL-6的分泌與巨噬細胞凋亡;
　　3.胰島素通過PI3K-AKT信