中藥成分對(duì)TGEV體外抑制作用及機(jī)制初步研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(swine transmissible gastroenteritis, TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritisvirus, TGEV)引發(fā)的豬的一種高度傳染性豬疾病。該病毒感染可導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉、厭食、嘔吐、脫水、無力，兩周齡以下仔豬死亡率最高，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒之一。為了探討連翹苷等中藥成分在豬感染 TGEV后，能夠發(fā)揮出怎樣的作用與機(jī)制，明確中藥成

2、分在體外作用并成功達(dá)到抗病毒的療效，本研究利用豬睪丸上皮細(xì)胞（ ST細(xì)胞）為感染模型，采用MTT比色法和細(xì)胞病變觀察法相結(jié)合，篩選出抗TGEV活性較好的中藥成分，將抗TGEV中藥成分不同作用方式下在ST細(xì)胞上與病毒結(jié)合，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及病毒量的變化，明確中藥成分抑制 TGEV增殖等一系列作用過程及初步原理。同時(shí)對(duì)篩選出的中藥成分進(jìn)行復(fù)方組合，觀察復(fù)方中藥成分對(duì) TGEV的作用療效，為抗TGEV的藥物篩選提供依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容包括：

3、　　1.藥物活性篩選細(xì)胞模型的建立
　　對(duì)長(zhǎng)滿單層的ST細(xì)胞感染TGEV強(qiáng)毒株病毒，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病理變化時(shí)，通過 RNA提取試劑盒提取病毒的總 RNA，用 cDNA第一鏈合成試劑盒生成新的cDNA。以所獲得的cDNA作為PCR模版進(jìn)行DNA的復(fù)制與合成，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出了條帶大小約0.75 kb的特異性片段，在最初設(shè)想的條帶大小范圍之內(nèi)。并進(jìn)行 TGEV測(cè)序及同源性分析。把 TGEV培養(yǎng)液連續(xù)十倍倍比稀釋，依次接種到布

4、滿單層ST細(xì)胞的96孔板上，設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)72 h，并對(duì)細(xì)胞病變情況進(jìn)行每天記錄。隨后根據(jù) Karber法計(jì)算病毒半數(shù)組織細(xì)胞感染量為10-6.25/0.1 mL，用細(xì)胞維持液配成100?TCID50病毒懸液，-70℃凍存?zhèn)溆?。這些步驟為篩選抗病毒中藥成分的細(xì)胞培養(yǎng)模型創(chuàng)造了條件。
　　2.抑制TGEV增殖中藥成分的體外篩選
　　將各中藥成分在最大安全的濃度范圍內(nèi)連續(xù)2倍倍比稀釋后，依次采用先感染病毒再用藥、先用藥后進(jìn)行病

5、毒感染、藥和病毒混合后感染 ST細(xì)胞三種方法來體外增殖抑制試驗(yàn)，通過酶標(biāo)儀測(cè)得630 nm處OD值，計(jì)算出不同作用方式下中藥成分分別對(duì) TGEV的抑制率，篩選出抗 TGEV活性較好的中藥成分，并分別記錄抗病毒效果最佳時(shí)藥物的濃度，6種中藥成分與病毒作用后，分別測(cè)定TGEV的病毒滴度并進(jìn)行分析比較、RT-PCR鑒定各個(gè)藥物成分對(duì)病毒 RNA合成的抑制效果。結(jié)果表明：6種中藥成分在 ST細(xì)胞上對(duì) TGEV均有達(dá)到有效的增殖抑制效果，其中，咖

6、啡酸直接殺滅病毒效果最顯著。了解中藥成分抗病毒的作用方法為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)中藥抗病毒的治療原理做了鋪墊。
　　3.復(fù)方中藥成分對(duì)TGEV的增殖抑制作用
　　對(duì)2中篩選的最佳抗 TGEV濃度的中藥成分進(jìn)行復(fù)方組合，第一組：連翹苷和連翹苷元；第二組：連翹苷和咖啡酸；第三組：連翹苷元和咖啡酸；第四組：連翹苷、連翹苷元和咖啡酸。將抗 TGEV最佳濃度的中藥成分復(fù)方組合后與病毒混合后感染細(xì)胞，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)