非小細(xì)胞肺癌中ASC基因啟動(dòng)子甲基化及甲基化抑制劑5-氮-2′-脫氧胞苷對(duì)肺癌細(xì)胞株增殖抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，肺癌在發(fā)達(dá)國(guó)家已占據(jù)所有惡性腫瘤發(fā)病率的首位，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率也在呈明顯的上升趨勢(shì)。盡管在過去的20年中肺癌的檢測(cè)和治療手段得到了改進(jìn)，但患者總的5年生存率不足15％，并且肺癌的生存率在過去的二十年中幾乎無任何顯著的改變。在肺癌中以非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)最多，約占肺癌的85％，便于取得病理標(biāo)本，是肺癌中研究最為深入的病理類型。對(duì)NSCLC的深入研究是提高肺癌病人長(zhǎng)期生

2、存率的關(guān)鍵，也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年來關(guān)注的焦點(diǎn)。 癌基因和抑癌基因的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)已得到公認(rèn)。過去的研究大多集中在基因結(jié)構(gòu)和數(shù)量上，認(rèn)為基因的突變、缺失等染色體改變是腫瘤形成的關(guān)鍵。近幾年來，隨著后基因組時(shí)代的到來，表遺傳學(xué)(epigenetics)研究越來越受到重視。DNA甲基化是表遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制。最近的研究表明，腫瘤相關(guān)基因甲基化不但在腫瘤的形成過程中起重要作用，而且，有可能成為腫瘤早期診斷的分子生物學(xué)指

3、標(biāo)和腫瘤基因治療的靶點(diǎn)之一。 在腫瘤DNA甲基化的研究中，抑癌基因甲基化是目前國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。抑癌基因甲基化是抑癌基因失活的一種重要機(jī)制，它發(fā)生在位于基因5'端相連的富含CpG二核苷酸的啟動(dòng)子區(qū)域，這一區(qū)域被稱為CpG島(CpGisland)。甲基化的DNA募集甲基結(jié)合蛋白，吸引一個(gè)和蛋白相連的染色體重塑復(fù)合物，然后通過去乙酰作用修飾組蛋白，從而關(guān)閉了基因的轉(zhuǎn)錄。 迄今為止，針對(duì)腫瘤抑制基因(tumorsuppress

4、genes，TSG)甲基化在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用已進(jìn)行了廣泛的研究。抑癌基因甲基化在肺癌的發(fā)病·1·機(jī)制中起著重要作用，可能是肺癌形成過程中的一個(gè)早期事件；另外，抑癌基因甲基化有可能成為肺癌早期診斷以及監(jiān)測(cè)治療效果或預(yù)后的具有高度特異性和敏感性的生物學(xué)指標(biāo)；去甲基化藥物使抑癌基因再表達(dá)也可能成為肺癌治療的一種新方法。 最近，Masumoto和Conway分別通過不同的方法分離鑒定了一個(gè)新的基因ASC(apoptosis-asso

5、ciatedspeck-likeproteincontainingaCARD)也被稱為TMS1(Targetofmethylation-inducingsilencing)。ASC基因位于染色體16p11.2-12.1，編碼一個(gè)含有CARD℃aspaserecruitmentdomain)的22kDa蛋白，具有促進(jìn)凋亡的作用。研究表明，黑色素瘤、大腸癌和卵巢癌腫瘤組織及細(xì)胞系中均存在ASC基因由甲基化導(dǎo)致的基因靜默。ASC基因甲基化與上

6、述腫瘤的形成和進(jìn)展有關(guān)。目前有關(guān)ASC基因在肺癌中的確切作用仍知之甚少。目前可檢索到的唯一一篇有關(guān)肺癌中ASC基因甲基化的報(bào)道是Arvind等2003年發(fā)表的。在他們的研究表明，ASC異常甲基化可見于48％的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和40％的非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織，并認(rèn)為ASC基因甲基化可能與NSCLC的形成有關(guān)。有鑒于此，我們準(zhǔn)備在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織、瘤旁正常肺組織及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中檢測(cè)ASC基因的異常甲基化情況并分析其與非小細(xì)胞肺癌腫

7、瘤細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，探討其在非小細(xì)胞肺癌形成和發(fā)展中的作用并為去甲基化藥物治療肺癌的基因靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 本文通過實(shí)驗(yàn)得出如下結(jié)果： 1.ASC基因啟動(dòng)子甲基化與NSCLC臨床特征之間的關(guān)系48例NSCLC的冰凍腫瘤組織和相應(yīng)的正常組織標(biāo)本中ASC基因甲基化的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NSCLC腫瘤組織與相對(duì)應(yīng)的正常肺組織中ASC基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率分別為47.9％(23/48)和8.3％(4/48)，有顯著差異(P＜0.001

8、，χ2=18.65)。存在ASC基因啟動(dòng)子甲基化的正常肺組織均來自于有重度吸煙史的鱗癌患者中，并且其相應(yīng)的腫瘤組織中均存在ASC基因的甲基化。重度吸煙患者的腫瘤組織中ASC基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率明顯增高(p=0.0089，χ2=6.8363)。另外，非小細(xì)胞肺癌的腫瘤大小也與ASC基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，較小的腫瘤組織中ASC基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于較大的腫瘤組織(p=0.335，χ2=4.5223)。研究還表明，ASC基因·5·啟動(dòng)

9、子的甲基化由于病人的年齡、性別、腫瘤的病理類型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)。 2.ASC基因啟動(dòng)子甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系70例有完整隨訪資料的NSCLC石蠟標(biāo)本經(jīng)MSP檢測(cè)并分析腫瘤組織中ASC基因啟動(dòng)子甲基化與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，不同病理分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有否ASC基因啟動(dòng)子甲基化分別與患者的五年生存的可能性之間均存在明顯的關(guān)系，ASC基因啟動(dòng)子甲基化陽性患者的5年生存率顯著降低(P=0.007，χ2=7.338)

10、。我們進(jìn)一步采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行回歸分析，其中除腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況外，ASC基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)亦是獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.009，回歸系數(shù)-1.035，風(fēng)險(xiǎn)度0.355，95％可信區(qū)間0.164-0.769)。 3.肺癌細(xì)胞系中ASC基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)顯示，在本研究所應(yīng)用的三個(gè)肺癌細(xì)胞系中，僅有A2細(xì)胞系存在明顯的ASC基因異常甲基化，其他兩個(gè)細(xì)胞系A(chǔ)549和calu-3并無AS

11、C基因甲基化的存在。 4.5-aza-CdR對(duì)甲基化的ASC基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)及誘導(dǎo)凋亡作用對(duì)存在ASC基因異常甲基化的A2細(xì)胞系應(yīng)用5-aza-CdR進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)ASC基因在RNA水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)5-aza-CdR處理后，ASC基因在RNA水平的表達(dá)上發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，由原來的不表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦卤磉_(dá)。而且，隨著5-aza-CdR濃度的增加，ASC基因表達(dá)水平有增強(qiáng)的趨勢(shì)。然而。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，5-aza-C

12、dR處理后，無論是否有ASC基因啟動(dòng)子異常甲基化的存在，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)649、A2、calu-3均出現(xiàn)了明顯的凋亡。而且，無論有否ASC基因啟動(dòng)子的甲基化，三個(gè)細(xì)胞系凋亡率的并無明顯的區(qū)別。 5.5-aza-CdR對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制經(jīng)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5-氮-2'-脫氧胞苷對(duì)肺癌細(xì)胞株的增殖有明顯的抑制作用，且這種作用具有劑量和時(shí)間依賴性。在濃度達(dá)到1.0ul時(shí)即出現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，應(yīng)用寇氏計(jì)算法計(jì)算48小時(shí)IC50為4.

13、20±0.12umol/L。在一定的范圍內(nèi)，隨著劑量的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的作用越明顯。 6.5-aza-CdR與化療藥物的協(xié)同作用Vp-16、ADM和DDP對(duì)A2肺癌細(xì)胞株的半數(shù)致死量分別為0.·6·25μmol/L、5.0μg/ml、0.25μg/ml。應(yīng)用較低濃度的5-氮-2'-脫氧胞苷誘導(dǎo)24h后，在加入上述濃度的各種化療藥物。結(jié)果顯示，Vp-16、ADM組的細(xì)胞存活率分別下降了25.3±2.6％和27.

14、1±3.1％，而DDP組的下降不明顯。 結(jié)論： 1.非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中存在ASC基因啟動(dòng)子的頻繁甲基化。 2.ASC基因啟動(dòng)子甲基化可能與吸煙引起的肺鱗癌的發(fā)生有關(guān)。 3.ASC基因啟動(dòng)子甲基化可能是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的早期分子學(xué)改變。 4.ASC基因啟動(dòng)子甲基化是影響NSCLC病人預(yù)后的獨(dú)立因素。 5.肺癌細(xì)胞系中存在因甲基化引起的ASC基因RNA表達(dá)的缺失。 6.甲基化的AS