基于槲皮素-al3+復(fù)合物的磷酸化蛋白檢測技術(shù)的研究.pdf

1、目的:
　　1.開發(fā)操作方便、成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高的凝膠上磷酸化蛋白質(zhì)熒光檢測方法;
　　2.采用多種公認(rèn)的磷酸化蛋白檢測技術(shù)共同驗證本方法在檢測磷酸化蛋白方面的特異性，以打破國外檢測技術(shù)的壟斷;
　　3.為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展提供合適的檢測技術(shù)。
　　方法:
　　1.利用槲皮素-Al3+復(fù)合物作為熒光探針初步建立檢測方法，之后考察各種影響檢測效果的因素，包括各步驟的組成成分及其濃度，最終

2、在聚丙烯酰胺凝膠上建立完整的磷酸化蛋白質(zhì)檢測方法。
　　2.采用一維凝膠電泳技術(shù)分別將標(biāo)準(zhǔn)白蛋(BSA和transferrin為非磷酸蛋白，作陰性對照;phosvitin，ovalbumin，α-casein和β-casein為磷酸化蛋白質(zhì)，作陽性對照)、小鼠各組織中提取的總蛋白以及去磷酸化處理前后的α-casein和β-casein進(jìn)行分離，將電泳后的蛋白凝膠用不同的磷酸化蛋白檢測技術(shù)分別進(jìn)行檢測分析，比較各個檢測技術(shù)的靈敏度、

3、磷酸化蛋白檢測特異性、線性范圍等各方面性質(zhì);
　　3.采用二維凝膠電泳技術(shù)對小鼠全腦蛋白進(jìn)行分離，將二維蛋白凝膠分別用槲皮素染色檢測方法和Pro-Q Diamond檢測方法進(jìn)行檢測分析，比較這兩種方法與二維凝膠電泳技術(shù)的兼容性;
　　4.與Western Blot檢測技術(shù)結(jié)果相互比較，以驗證本方法檢測磷酸化蛋白的特異性;
　　5.采用生物質(zhì)譜技術(shù)對槲皮素-Al3+復(fù)合物檢測到的凝膠上磷酸化蛋白條帶進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步驗證本

4、方法檢測磷酸化蛋白質(zhì)的特異性。
　　結(jié)果:
　　1.采用槲皮素-Al3+復(fù)合物作為熒光探針，考察和篩選了各種影響因素，最終在聚丙烯酰胺凝膠上成功建立了一種新型的磷酸換蛋白檢測技術(shù)，具體操作步驟如下所示:
　　(1)固定:將電泳之后的蛋白凝膠放置于100 mL固定液中固定20分鐘，固定液組成:30％甲醇/10％乙酸;
　　(2)水洗:將凝膠放置于50 mL去離子水中洗滌2次，每次5分鐘;
　　(3)染色:將凝

5、膠放置于50 mL的染色液中染色60分鐘，染色液組成:25μM槲皮素，50μM Al3+，20％1，2-丙二醇，40％甲醇;
　　(4)脫色:將凝膠放置于50 mL脫色液中脫色3～5分鐘，脫色液組成:50％甲醇，250mM乙酸鈉，pH4.5（鹽酸調(diào)節(jié)pH）。
　　2.實驗結(jié)果顯示，本方法檢測靈敏度達(dá)到了16-32 ng，優(yōu)于Stains-All檢測法，與Pro-Q Diamond檢測法相當(dāng);除此之外，本方法對磷酸化蛋白具有相

6、當(dāng)高的檢測特異性;
　　3.小鼠各個組織樣品總蛋白染色檢測結(jié)果顯示，槲皮素染色檢測法所檢測出的蛋白條帶與Pro-Q Diamond染色檢測法十分接近，說明本方法在檢測磷酸化蛋白質(zhì)方面具有非常良好的特異性，與Pro-Q Diamond染色檢測法相當(dāng);
　　4.根據(jù)磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化實驗結(jié)果所示，去磷酸化后的磷酸化蛋白用本方法基本檢測不出來，而未去磷酸化的磷酸化蛋白質(zhì)則可以很好地被本方法檢測顯示，結(jié)果與Pro-Q Diamon

7、d染色檢測法相近，證明了本方法在檢測磷酸化蛋白質(zhì)方面具有良好的特異性;
　　5.根據(jù)二維凝膠電泳實驗結(jié)果所示，本方法所檢測出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與Pro-QDiamond染色檢測法所檢測出的蛋白斑點(diǎn)十分相近，證明了本方法能夠與二維凝膠相互兼容和特異性;
　　6.根據(jù)Western Blot結(jié)果所示，本方法從小鼠大腦總蛋白中檢測出的蛋白條帶與Western Blot所檢測出的條帶十分接近，證明了本方法在檢測磷酸化蛋白質(zhì)方面具有非常良好