APEX1,Jagged1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　從mRNA及蛋白水平檢測(cè)脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APEX1）、jagged1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）組織中的表達(dá)情況，并探討其與HCC臨床病理特征的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性。檢測(cè)HCC中Notch信號(hào)通路受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 mRNA的表達(dá)，分析jagged1與四個(gè)受體之間的相關(guān)性。構(gòu)建LV-APEX1-RNAi慢病毒表達(dá)載體，

2、觀察靶向干擾APEX1后對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，檢測(cè)其介導(dǎo)的RNAi干擾對(duì)SMMC-7721細(xì)胞APEX1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，并檢測(cè)jagged1表達(dá)的變化，探討APEX1在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法：
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）技術(shù)，從mRNA水平上檢測(cè)46例HCC及相應(yīng)癌旁和遠(yuǎn)癌肝組織，13例正常肝組織中APEX1、jagged1的表達(dá)情況，并分析

3、APEX1與jagged1表達(dá)的相關(guān)性；檢測(cè)36例HCC中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4 mRNA的表達(dá)，分析其與jagged1的相關(guān)性。
　　2.采用蛋白免疫印跡（Western Blot）方法在蛋白質(zhì)水平上分別檢測(cè)了25例HCC及癌旁正常肝組織中 APEX1蛋白表達(dá)及18例HCC及癌旁正常肝組織中jagged1蛋白。
　　3.采用免疫組織化學(xué)染色（IHC）方法結(jié)合組織芯片技術(shù)，檢測(cè)119例HCC、

4、癌旁肝組織中APEX1、jagged1蛋白表達(dá)情況；并分析上述蛋白表達(dá)的相關(guān)性、與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　4.培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，使用慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA技術(shù)，用構(gòu)建的LV-APEX1-RNAi（實(shí)驗(yàn)組）表達(dá)載體感染細(xì)胞，并設(shè)LV-APEX1-NC（空載體）組，Real-time PCR及Western Blot檢測(cè)感染后肝癌細(xì)胞中APEX1的mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　5.選擇APEX1表達(dá)下

5、調(diào)的SMMC-7721細(xì)胞（SMMC-7721-LV-APEX1-RNAi）及它的對(duì)照組細(xì)胞，通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）比色法和Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力的變化。
　　6.Western Blot檢測(cè)感染LV-APEX1-RNAi后肝癌細(xì)胞中jagged1表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示APEX1 mRNA在HCC、癌旁、遠(yuǎn)癌及正常肝組織中的相對(duì)表達(dá)量（Re

6、lative quantity，RQ）分別為2.154±1.644、1.152±0.689、1.352±0.818、0.960±0.039。APEX1 mRNA在HCC中的表達(dá)明顯高于癌旁、遠(yuǎn)癌和正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HCC組織中APEX1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平和HCC組織的分化程度、有無(wú)包膜侵犯及術(shù)后有無(wú)復(fù)發(fā)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。除外，APEX1的表達(dá)水平和年齡、性別、術(shù)前AFP水平、是否合

7、并肝硬化、有無(wú)乙肝表面抗原、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目無(wú)關(guān)。
　　2.Western Blot及免疫組化結(jié)果顯示APEX1蛋白及jagged1蛋白在HCC中的表達(dá)均高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.結(jié)合免疫組化中jagged1蛋白的表達(dá)情況和HCC患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示Jagged1蛋白表達(dá)與HCC的分化程度、術(shù)前AFP、是否轉(zhuǎn)移及術(shù)后是否復(fù)發(fā)關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除外，jagged1的表達(dá)與性別、年

8、齡、腫瘤大小、有無(wú)硬化、有無(wú)脈管癌栓等均無(wú)關(guān)(P>0.05)
　　4.經(jīng)過(guò)Spearman秩相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在HCC中APEX1與jagged1的表達(dá)存在正相關(guān)性（P<0.05）；在mRNA水平j(luò)agged1的表達(dá)與Notch信號(hào)通路Notch3的表達(dá)存在正相關(guān)性（r=0.501，P=0.002），與Notch1、Notch2、Notch4的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.055，P=0.750；r=-0.236，P=0.640；r=-0.1

9、38，P=0.421）。
　　5.SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒LV-APEX1-RNAi后，與空載體NC組相比，其APEX1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SMMC-7721-LV-APEX1-RNAi的增殖速度較空載體 NC組明顯減慢（P<0.01），Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其侵襲及遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。
　　7.SMMC-7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒LV-APEX1-RN