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文檔簡介
1、目的:IL-23是IL-12家族的新成員,通過Th17在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要的促炎作用,但是IL-23的抗腫瘤作用尚有爭議。本研究將通過構(gòu)建可溶性IL-23受體蛋白鏈(sIL23Rc)表達載體pcDNA3.1/sIL23Rc,通過尾靜脈高通量流體動力學注射法注射入荷瘤小鼠肝臟,使其體內(nèi)表達以全身性封閉IL-23,探討IL-23對腫瘤生長的作用及其免疫學機制。
方法:1、利用RT-PCR手段,擴增IL-23受體復(fù)合物的兩個亞
2、基胞外域的cDNA片段并在IL-12RB1片段3’端引入連接肽cDNA,利用T-A克隆獲得高豐度的IL-12RB1和IL-23R的cDNA片段,將其與pcDNA3.1載體連接,獲得真核表達載體pcDNA3.1/sIL23Rc,表達可溶性IL-23受體蛋白鏈(sIL23Rc),利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)上清中sIL23Rc的表達;利用RT-PCR檢測sIL23Rc封閉IL-23的能力。2、通過尾靜脈高通量流體動
3、力學注射法將質(zhì)粒注射入荷瘤小鼠肝臟并表達sIL23Rc以封閉IL-23,觀察其對腫瘤生長的影響。3、利用RT-PCR和Western blot檢測H22腫瘤細胞系、腫瘤組織分離的新鮮H22細胞和H22腫瘤組織中IL-23R的表達情況;使用裸鼠驗證IL-23對腫瘤生長的作用是否主要依賴于T細胞。4、利用流式細胞術(shù)檢測經(jīng)sIL23Rc封閉IL-23后荷瘤小鼠脾臟和腫瘤浸潤樹突狀細胞的成熟情況。5、使用低劑量環(huán)磷酰胺清除荷瘤小鼠調(diào)節(jié)性T細胞后
4、,觀察sIL23Rc對腫瘤生長,利用流式細胞術(shù)檢測樹突狀細胞的成熟情況;利用RT-PCR和ELISA檢測sIL23Rc對荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-17表達的影響。
結(jié)果:1、pcDNA3.1/sIL23Rc能夠表達可分泌的、有功能的IL-23受體蛋白鏈(sIL23Rc)。2、sIL23Rc能夠促進小鼠H22肝癌的生長。3、IL-23不能直接作用于H22細胞;sIL23Rc對荷瘤裸鼠H22腫瘤的生長沒有影響。4、sIL23Rc抑制
5、荷瘤小鼠脾臟及腫瘤浸潤樹突狀細胞的成熟。5、清除調(diào)節(jié)性T細胞后,sIL23Rc對BALB/c小鼠H22腫瘤的生長和脾臟及腫瘤浸潤淋巴細胞中樹突狀細胞的成熟沒有影響;sIL23Rc沉默荷瘤小鼠腫瘤組織中的IL-17的表達。
結(jié)論:sIL23Rc以可溶性形式封閉IL-23。sIL23Rc可能通過調(diào)節(jié)Th17途徑增強調(diào)節(jié)性T細胞的作用,導(dǎo)致后者對樹突狀細胞成熟的抑制而促進腫瘤生長。我們的實驗結(jié)果支持IL-23具有增強抗腫瘤免疫的作用
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