主動(dòng)脈瘤與夾層病變中ADAMTS-4作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分ADAMTS-1,4在主動(dòng)脈瘤與夾層病人組織中的表達(dá)
　　目的：ADAMTS是新近發(fā)現(xiàn)的一類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的金屬蛋白酶家族。我們假設(shè)ADAMTS-1和ADAMTS-4在主動(dòng)脈瘤與夾層的病人中的表達(dá)升高。我們旨在檢測(cè)ADAMTS-1和ADAMTS-4在主動(dòng)脈瘤與夾層的病人組織中的表達(dá)情況。
　　方法：WesternBlot(WB)和RT-PCR檢測(cè)ADAMTS-1、

2、ADAMTS-4在降主動(dòng)脈瘤TAA(n=14)、慢性降主動(dòng)脈夾層病人TAD(n=16)和年齡與病例組相匹配的正常器官捐獻(xiàn)者control(n=12)的降主動(dòng)脈中的表達(dá)。免疫組化(IHC)確定其表達(dá)部位,免疫熒光雙標(biāo)(IF)確定其細(xì)胞來源。WB評(píng)價(jià)ADAMTS-1與ADAMTS-4的底物多功能蛋白聚糖(versican)的降解情況。
　　結(jié)果：ADAMTS-1和ADAMTS-4的蛋白、mRNA表達(dá)水平在TAA、TAD中顯著高于正常對(duì)

3、照組,ADAMTS-1和ADAMTS-4表達(dá)于病變血管的內(nèi)膜、中膜及外膜層。ADAMTS-1和ADAMTS-4主要表達(dá)于中膜層的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和外膜層的巨噬細(xì)胞。ADAMTS-1和ADAMTS-4的升高與多功能蛋白聚糖的降解相一致。 結(jié)論：ADAMTS蛋白酶的升高可能通過降解多功能蛋白聚糖以及促進(jìn)炎癥反應(yīng)而參與主動(dòng)脈瘤與夾層的發(fā)生與發(fā)展。
　　第二部分ADAMTS-4對(duì)巨噬細(xì)胞遷移、血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用

4、>　　目的：檢測(cè)ADAMTS-4基因敲除對(duì)人和小鼠的巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的影響,探索ADAMTS-4的調(diào)節(jié)基質(zhì)。
　　方法：炎癥因子刺激人類巨噬細(xì)胞,WB檢測(cè)ADAMTS-4的表達(dá),ADAMTS-4siRNA轉(zhuǎn)染人類巨噬細(xì)胞,細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell)檢測(cè)轉(zhuǎn)然后巨噬細(xì)胞的遷移能力。從ADAMTS-4敲除的小鼠(ADAMTA-4-/-)中提取巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞(VSMC),細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的遷移能力,軟脂酸

5、(palmiticacid,PA)刺激血管平滑肌細(xì)胞,TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：TGF-β可促進(jìn)人巨噬細(xì)胞表ADAMTS-4,在巨噬細(xì)胞中敲除ADAMTS-4可以減少巨噬細(xì)胞的遷移,ADAMTA-4-/-小鼠的巨噬細(xì)胞的遷移能力低于WT的小鼠。給予PA刺激后,ADAMTS-4-/-的小鼠的血管平滑肌細(xì)胞的凋亡少于WT小鼠。
　　結(jié)論：炎癥因子可促進(jìn)ADAMTS

6、-4的表達(dá),同時(shí)ADAMTS-4可參與巨噬細(xì)胞的遷移,參與炎癥反應(yīng)。ADAMTS-4減少使血管平滑肌細(xì)胞的凋亡減少,ADAMTS-4與血管平滑肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。ADAMTS-4參與巨噬細(xì)胞的遷移、血管平滑肌細(xì)胞的凋亡促進(jìn)疾病的發(fā)生。
　　第三部分ADAMTS-4基因敲除在小鼠主動(dòng)脈瘤模型中的作用
　　目的：建立主動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型,檢測(cè)在ADAMTS-4基因敲除的小鼠中,其主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率是否減少。
　　方法：建立主動(dòng)脈瘤

7、模型,模型一,將4周大的WT小鼠分為對(duì)照組(n=7)與處理組(n=13),4周大的ADAMTS-4-/-小鼠分為對(duì)照組(n=7)與處理組(n=19),給予對(duì)照組小鼠正常飲食(CD)和生理鹽水(saline),處理組給予高脂飲食(HFD)和血管經(jīng)張素P(AngP)。模型二,給予4周大的Apoe-/-小鼠(n=17)、Apoe-/-Adamts4-/-小鼠(n=15)高脂飲食(HFD)和血管經(jīng)張素P(AngP)。8周后,取下小鼠主動(dòng)脈,評(píng)價(jià)

8、小鼠的發(fā)病率,免疫組化(IHC)檢測(cè)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,酶譜分析(zymography)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的活性。 結(jié)果：WT與ADAMTS4-/-小鼠的血壓沒有區(qū)別,動(dòng)脈瘤與夾層在ADAMTS-4-/-的老鼠中的發(fā)病率顯著少于WT小鼠(P=0.04),VSMC的凋亡在ADAMTS-4-/-的小鼠主動(dòng)脈中少于WT老鼠(P=0.02),巨噬細(xì)胞在ADAMTS-4-/-的小鼠主動(dòng)脈的表達(dá)中少于WT老鼠(P

9、=0.003),多功能蛋白聚糖Versican在ADAMTS-4-/-老鼠主動(dòng)脈中的降解少于WT老鼠(P=0.009),MMP蛋白酶在ADAMTS-4-/-老鼠主動(dòng)脈中的活性低于WT老鼠。主動(dòng)脈瘤與夾層在Apoe-/-Adamts4-/-老鼠中的發(fā)病率低于Apoe-/-老鼠(P=0.033),主動(dòng)脈瘤破裂在Apoe-/-Adamts4-/-老鼠中的顯著低于Apoe-/-老鼠(P=0.041),28天生存率顯著提高(P=0.023),Ap

10、oe-/-和Apoe-/-Adamts4-/-老鼠血清中的膽固醇含量沒有區(qū)別(P>0.05),多功能糖蛋白Versican的降解在Apoe-/-Adamts4-/-老鼠中少于Apoe-/-老鼠(P=0.002),雙糖鏈蛋白多糖Biglycan的表達(dá)多于Apoe-/-老鼠(P=0.005),Apoe-/-Adamts4-/-老鼠的主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡少于Apoe-/-老鼠(P=0.001),淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化蛋白-1MCP-1表達(dá)

11、少于Apoe-/-老鼠(P=0.003,P<0.001,P=0.011)。
　　結(jié)論：我們的研究表明主動(dòng)脈瘤與夾層的發(fā)病率在ADAMTS-4-/-、Apoe-/-Adamts4-/-老鼠中要顯著低于WT、Apoe-/-老鼠。Apoe-/-Adamts4-/-老鼠的主動(dòng)脈瘤破裂發(fā)生率顯著低于Apoe-/-老鼠,28天生存率顯著長(zhǎng)于Apoe-/-老鼠。其主要機(jī)制可能是ADAMTS-4基因敲除后炎癥細(xì)胞的表達(dá)降低,主動(dòng)脈管壁中細(xì)胞外基質(zhì)