七葉皂苷鈉對(duì)急性低氧暴露下大鼠血腦屏障的保護(hù)作用及抗?jié)B漏機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 高原腦水腫(HACE)是機(jī)體近期抵達(dá)高原后，在低壓性缺氧環(huán)境下迅速出現(xiàn)的一種特殊的急性重癥高原病(ASMS)。雖然高原低壓性缺氧是HACE發(fā)生的始動(dòng)因素，但迄今為止人們對(duì)它潛在的具體發(fā)生機(jī)制仍然不清，加之該病具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、不及時(shí)診治易并發(fā)危象等臨床特點(diǎn)，早期預(yù)防和診斷還缺乏客觀(guān)檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)急進(jìn)高原人群危害極大。
　　 目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HACE的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與血腦屏障(BBB)通透性的迅

2、速變化密切相關(guān)。在BBB破壞導(dǎo)致各種腦水腫的形成中，緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白：包括咬合蛋白Occludin、胞質(zhì)附著蛋白Zo-1、閉鎖蛋白Claudin-5等，它們的降解和功能的缺失，以及炎癥性核因子NF-κB的被動(dòng)激活均起了關(guān)鍵作用。既往的研究證實(shí)，在缺血缺氧或缺血再灌注損傷等應(yīng)激發(fā)生時(shí)，能直接或間接引起Occludin、Zo-1和Claudin-5在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，使緊密連接(TJs)“咬合”狀態(tài)受損，BBB呈高滲漏性。同時(shí)

3、應(yīng)激情況下腦內(nèi)NF-κB由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為有轉(zhuǎn)錄功能的活性狀態(tài)，一方面激活MMPs家族，破壞血管基底膜，導(dǎo)致血管源性腦水腫發(fā)生；另一方面產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)一步加重水腫程度。因此我們推測(cè)：Occludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB均參與了缺氧條件下HACE的發(fā)生，是其形成、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的重要靶點(diǎn)分子。
　　 七葉皂苷鈉具有抗炎、抗?jié)B漏、消除腫脹、清除氧自由基和恢復(fù)毛細(xì)血管正常通透性等生物學(xué)功效

4、，臨床已廣泛用于平原地區(qū)各型腦水腫的治療，效果確切肯定。以往對(duì)七葉皂苷鈉治療腦水腫相關(guān)藥理機(jī)制的研究，多局限于常壓常氧情況下各種腦血管疾病，對(duì)高原地區(qū)低壓缺氧性腦疾病作用機(jī)制的研究還甚少。因此觀(guān)察七葉皂苷鈉對(duì)HACE的防治效果，研究其可能藥理機(jī)制很有意義。
　　 基于以上研究背景，我們采用急性低壓低氧暴露復(fù)合力竭運(yùn)動(dòng)法建立實(shí)驗(yàn)性高原腦水腫大鼠動(dòng)物模型，以此為平臺(tái)觀(guān)察七葉皂苷鈉對(duì)HACE大鼠腦血管內(nèi)皮屏障和腦組織的保護(hù)效果，闡述O

5、ccludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB表達(dá)的變化規(guī)律，以及與HACE病理改變之間的可能相關(guān)聯(lián)系，以期更深入地探討HACE的具體發(fā)生機(jī)制和七葉皂苷鈉對(duì)HACE的相關(guān)防治藥理機(jī)制，旨在進(jìn)一步為HACE的臨床治療提供理論幫助，并篩選更有效的潛在的靶點(diǎn)預(yù)防與治療藥物。
　　 研究方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)性高原腦水腫動(dòng)物模型的建立：健康成年雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為平原對(duì)照組(PC)和高原缺氧組(AH)兩組，每組各

6、20只。平原環(huán)境下高原缺氧組大鼠先進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練2d，結(jié)束后立即放入模擬海拔高度4000m的高原環(huán)境模擬艙內(nèi)，進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)2d。再將模擬高度迅速調(diào)整到8000m，高原缺氧組大鼠繼續(xù)單純減壓缺氧暴露3d。艙內(nèi)溫度約18℃，光暗周期24h，自由進(jìn)食飲水。平原對(duì)照組不作減壓缺氧處理，平原環(huán)境下籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。最后在模擬海拔5000m高度的環(huán)境中，對(duì)高原缺氧組大鼠迅速取材，平原對(duì)照組在平原下取材。通過(guò)檢測(cè)腦組織含水量、伊文思藍(lán)(EB)含量，觀(guān)

7、察腦組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)改變以及硝酸鑭示蹤鑭顆粒分布情況，綜合評(píng)價(jià)動(dòng)物模型。
　　 2.七葉皂苷鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)性高原腦水腫動(dòng)物的保護(hù)機(jī)制研究：健康成年雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為平原對(duì)照組(PC)、平原藥物組(PD)、高原缺氧組(AH)和缺氧治療組(HT)四組，每組各25只。按實(shí)驗(yàn)性HACE動(dòng)物模型制備方法建立大鼠HACE模型。高原缺氧組和缺氧治療組大鼠在高原環(huán)境模擬艙內(nèi)作減壓缺氧處理，余兩組在平原常氧環(huán)境下分籠常規(guī)飼養(yǎng)。在模擬海拔

8、4000m高度力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束即刻，缺氧治療組大鼠開(kāi)始給予七葉皂苷鈉5mg/kg.bw，腹腔注射一次。在模擬海拔8000m缺氧暴露的第一天和第二天晨，將模擬艙高度降至5000m高度后，缺氧治療組大鼠同法追加七葉皂苷鈉，1/d。注射結(jié)束后迅速恢復(fù)減壓高度至8000m，大鼠繼續(xù)減壓缺氧。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，高原缺氧組和平原對(duì)照組同法給予0.9%氯化鈉注射液處理，平原藥物組給予七葉皂苷鈉處理(作空白對(duì)照用)。減壓結(jié)束后檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦含水量、EB相對(duì)

9、含量、腦組織病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)變化和硝酸鑭分布情況，并測(cè)定各組動(dòng)物腦額頂葉皮質(zhì)部occludin、zo-1、claudin-5mRNA表達(dá)水平以及Occludin、NF-κB P65總蛋白含量。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.與平原對(duì)照組比較，高原缺氧組大鼠腦組織含水量和伊文思藍(lán)相對(duì)含量顯著增加(P<0.01)；光鏡下見(jiàn)高原缺氧組海馬錐體細(xì)胞排列層數(shù)減少，脫失嚴(yán)重，水腫明顯；透射電鏡下見(jiàn)腦組織結(jié)構(gòu)十分疏松，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密

10、連接間隙增大，大量高電子密度的鑭顆粒通過(guò)開(kāi)放的緊密連接滲漏到微血管管腔外側(cè)周?chē)g隙。部分神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器腫脹，神經(jīng)纖維水腫。
　　 2.缺氧治療組腦含水量和EB含量較高原缺氧組顯著降低，組間比較有顯著性差異(P<0.05)。與高原缺氧組比較，光鏡下缺氧治療組海馬結(jié)構(gòu)輕度異常，錐體細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞脫失程度較輕；透射電鏡下缺氧治療組腦組織輕度疏松化，大量鑭顆粒主要沉積在血管腔內(nèi)側(cè)壁，少量滲漏到微血管外側(cè)和腦組織間隙，水腫程

11、度輕。與平原對(duì)照組比較，高原缺氧組occludin、zo-1、claudin-5基因表達(dá)顯著降低(P<0.01，P<0.05，P>0.05)；與高原缺氧組比較，缺氧治療組occludin、zo-1、claudin-5基因表達(dá)顯著回升，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，在高原缺氧組Occludin蛋白表達(dá)水平明顯降低，在缺氧治療組中表達(dá)明顯升高，高原缺氧組與缺氧治療組、高原缺氧組與平原對(duì)照組比較，均有顯著性差異(P<0.05)；

12、NF-κBP65蛋白水平呈相反趨勢(shì)，在高原缺氧組與平原對(duì)照組兩組間比較有顯著性差異(P<0.05)，而在四組均值間兩兩比較則無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.采用急性低壓低氧暴露復(fù)合力竭運(yùn)動(dòng)法成功建立實(shí)驗(yàn)性高原腦水腫動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究HACE發(fā)生機(jī)制和相關(guān)藥物作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.急性低壓低氧暴露下，SD大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接呈開(kāi)放狀態(tài)，BBB嚴(yán)重破壞，通透性明顯增加，水腫形

13、成；海馬錐體細(xì)胞脫失嚴(yán)重，部分神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器腫脹，神經(jīng)系統(tǒng)受損嚴(yán)重。
　　 3.急性低壓低氧暴露下，高原腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸和BBB中TJs關(guān)鍵蛋白o(hù)ccludin、zo-1、claudin-5基因及Occludin蛋白表達(dá)的急劇減少密切相關(guān)，同時(shí)與NF-κBP65的迅速增多緊密聯(lián)系。提示腦組織中Occludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB可能是HACE發(fā)生與防治中的有效干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 4.給