七葉皂苷鈉對急性低氧暴露下大鼠血腦屏障的保護作用及抗?jié)B漏機制研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 高原腦水腫(HACE)是機體近期抵達高原后，在低壓性缺氧環(huán)境下迅速出現(xiàn)的一種特殊的急性重癥高原病(ASMS)。雖然高原低壓性缺氧是HACE發(fā)生的始動因素，但迄今為止人們對它潛在的具體發(fā)生機制仍然不清，加之該病具有起病隱匿、進展迅速、不及時診治易并發(fā)危象等臨床特點，早期預防和診斷還缺乏客觀檢測指標，對急進高原人群危害極大。
　　 目前多數(shù)學者認為HACE的發(fā)生、發(fā)展及預后與血腦屏障(BBB)通透性的迅

2、速變化密切相關(guān)。在BBB破壞導致各種腦水腫的形成中，緊密連接結(jié)構(gòu)蛋白：包括咬合蛋白Occludin、胞質(zhì)附著蛋白Zo-1、閉鎖蛋白Claudin-5等，它們的降解和功能的缺失，以及炎癥性核因子NF-κB的被動激活均起了關(guān)鍵作用。既往的研究證實，在缺血缺氧或缺血再灌注損傷等應激發(fā)生時，能直接或間接引起Occludin、Zo-1和Claudin-5在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平發(fā)生改變，使緊密連接(TJs)“咬合”狀態(tài)受損，BBB呈高滲漏性。同時

3、應激情況下腦內(nèi)NF-κB由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)為有轉(zhuǎn)錄功能的活性狀態(tài)，一方面激活MMPs家族，破壞血管基底膜，導致血管源性腦水腫發(fā)生；另一方面產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應，引起腦細胞結(jié)構(gòu)和功能受損，進一步加重水腫程度。因此我們推測：Occludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB均參與了缺氧條件下HACE的發(fā)生，是其形成、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的重要靶點分子。
　　 七葉皂苷鈉具有抗炎、抗?jié)B漏、消除腫脹、清除氧自由基和恢復毛細血管正常通透性等生物學功效

4、，臨床已廣泛用于平原地區(qū)各型腦水腫的治療，效果確切肯定。以往對七葉皂苷鈉治療腦水腫相關(guān)藥理機制的研究，多局限于常壓常氧情況下各種腦血管疾病，對高原地區(qū)低壓缺氧性腦疾病作用機制的研究還甚少。因此觀察七葉皂苷鈉對HACE的防治效果，研究其可能藥理機制很有意義。
　　 基于以上研究背景，我們采用急性低壓低氧暴露復合力竭運動法建立實驗性高原腦水腫大鼠動物模型，以此為平臺觀察七葉皂苷鈉對HACE大鼠腦血管內(nèi)皮屏障和腦組織的保護效果，闡述O

5、ccludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB表達的變化規(guī)律，以及與HACE病理改變之間的可能相關(guān)聯(lián)系，以期更深入地探討HACE的具體發(fā)生機制和七葉皂苷鈉對HACE的相關(guān)防治藥理機制，旨在進一步為HACE的臨床治療提供理論幫助，并篩選更有效的潛在的靶點預防與治療藥物。
　　 研究方法
　　 1.實驗性高原腦水腫動物模型的建立：健康成年雄性SD大鼠40只，隨機分為平原對照組(PC)和高原缺氧組(AH)兩組，每組各

6、20只。平原環(huán)境下高原缺氧組大鼠先進行適應性跑臺訓練2d，結(jié)束后立即放入模擬海拔高度4000m的高原環(huán)境模擬艙內(nèi)，進行力竭運動2d。再將模擬高度迅速調(diào)整到8000m，高原缺氧組大鼠繼續(xù)單純減壓缺氧暴露3d。艙內(nèi)溫度約18℃，光暗周期24h，自由進食飲水。平原對照組不作減壓缺氧處理，平原環(huán)境下籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。最后在模擬海拔5000m高度的環(huán)境中，對高原缺氧組大鼠迅速取材，平原對照組在平原下取材。通過檢測腦組織含水量、伊文思藍(EB)含量，觀

7、察腦組織病理學、超微結(jié)構(gòu)改變以及硝酸鑭示蹤鑭顆粒分布情況，綜合評價動物模型。
　　 2.七葉皂苷鈉對實驗性高原腦水腫動物的保護機制研究：健康成年雄性SD大鼠100只，隨機分為平原對照組(PC)、平原藥物組(PD)、高原缺氧組(AH)和缺氧治療組(HT)四組，每組各25只。按實驗性HACE動物模型制備方法建立大鼠HACE模型。高原缺氧組和缺氧治療組大鼠在高原環(huán)境模擬艙內(nèi)作減壓缺氧處理，余兩組在平原常氧環(huán)境下分籠常規(guī)飼養(yǎng)。在模擬海拔

8、4000m高度力竭運動結(jié)束即刻，缺氧治療組大鼠開始給予七葉皂苷鈉5mg/kg.bw，腹腔注射一次。在模擬海拔8000m缺氧暴露的第一天和第二天晨，將模擬艙高度降至5000m高度后，缺氧治療組大鼠同法追加七葉皂苷鈉，1/d。注射結(jié)束后迅速恢復減壓高度至8000m，大鼠繼續(xù)減壓缺氧。在相應時間點，高原缺氧組和平原對照組同法給予0.9%氯化鈉注射液處理，平原藥物組給予七葉皂苷鈉處理(作空白對照用)。減壓結(jié)束后檢測各組實驗動物腦含水量、EB相對

9、含量、腦組織病理學、超微結(jié)構(gòu)變化和硝酸鑭分布情況，并測定各組動物腦額頂葉皮質(zhì)部occludin、zo-1、claudin-5mRNA表達水平以及Occludin、NF-κB P65總蛋白含量。
　　 實驗結(jié)果
　　 1.與平原對照組比較，高原缺氧組大鼠腦組織含水量和伊文思藍相對含量顯著增加(P<0.01)；光鏡下見高原缺氧組海馬錐體細胞排列層數(shù)減少，脫失嚴重，水腫明顯；透射電鏡下見腦組織結(jié)構(gòu)十分疏松，腦微血管內(nèi)皮細胞緊密

10、連接間隙增大，大量高電子密度的鑭顆粒通過開放的緊密連接滲漏到微血管管腔外側(cè)周圍間隙。部分神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞細胞器腫脹，神經(jīng)纖維水腫。
　　 2.缺氧治療組腦含水量和EB含量較高原缺氧組顯著降低，組間比較有顯著性差異(P<0.05)。與高原缺氧組比較，光鏡下缺氧治療組海馬結(jié)構(gòu)輕度異常，錐體細胞排列較整齊，細胞脫失程度較輕；透射電鏡下缺氧治療組腦組織輕度疏松化，大量鑭顆粒主要沉積在血管腔內(nèi)側(cè)壁，少量滲漏到微血管外側(cè)和腦組織間隙，水腫程

11、度輕。與平原對照組比較，高原缺氧組occludin、zo-1、claudin-5基因表達顯著降低(P<0.01，P<0.05，P>0.05)；與高原缺氧組比較，缺氧治療組occludin、zo-1、claudin-5基因表達顯著回升，組間比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，在高原缺氧組Occludin蛋白表達水平明顯降低，在缺氧治療組中表達明顯升高，高原缺氧組與缺氧治療組、高原缺氧組與平原對照組比較，均有顯著性差異(P<0.05)；

12、NF-κBP65蛋白水平呈相反趨勢，在高原缺氧組與平原對照組兩組間比較有顯著性差異(P<0.05)，而在四組均值間兩兩比較則無顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.采用急性低壓低氧暴露復合力竭運動法成功建立實驗性高原腦水腫動物模型，為進一步研究HACE發(fā)生機制和相關(guān)藥物作用機理奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.急性低壓低氧暴露下，SD大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞緊密連接呈開放狀態(tài)，BBB嚴重破壞，通透性明顯增加，水腫形

13、成；海馬錐體細胞脫失嚴重，部分神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞細胞器腫脹，神經(jīng)系統(tǒng)受損嚴重。
　　 3.急性低壓低氧暴露下，高原腦水腫的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸和BBB中TJs關(guān)鍵蛋白occludin、zo-1、claudin-5基因及Occludin蛋白表達的急劇減少密切相關(guān)，同時與NF-κBP65的迅速增多緊密聯(lián)系。提示腦組織中Occludin、Zo-1、Claudin-5和NF-κB可能是HACE發(fā)生與防治中的有效干預靶點。
　　 4.給