釉基質(zhì)蛋白在體外對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的作用及其共同在牙周再生中的應(yīng)用.pdf

1、背景和目的：牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥過(guò)程而破壞的牙周組織，恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能，即實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織，其修復(fù)與重建的難度很大。多年來(lái)，人們一直在尋求能有效增加牙周新附著、促進(jìn)牙周組織再生的治療方法，并己開展了牙周骨移植、引導(dǎo)牙周組織再生(GTR)技術(shù)等多方面的研究，取得了一定的進(jìn)展，但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠(yuǎn)未達(dá)到所期望的目標(biāo)。組織工程應(yīng)用于牙周組織缺損修復(fù)為牙周病的治療開辟了一條新途徑。

2、>　　 組織工程學(xué)的主要研究重點(diǎn)在于以下三個(gè)方面：(1)種子細(xì)胞的來(lái)源；(2)生物載體支架材料的選擇；(3)有效的細(xì)胞因子。要進(jìn)行系統(tǒng)的牙周組織工程研究，就必須首先對(duì)以上三個(gè)問(wèn)題進(jìn)行探討、研究和解決。其中，選擇合適的種子細(xì)胞和有效的細(xì)胞因子是非常重要的。
　　 誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem cells，iPS細(xì)胞)來(lái)源于成體細(xì)胞，其獲得方法相對(duì)簡(jiǎn)單穩(wěn)定。不需要使用生殖細(xì)胞或破壞早期胚胎。

3、在技術(shù)上和倫理上都更有優(yōu)勢(shì)。iPS細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStem Cells，ESC)相似的生物學(xué)特性并能在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞，是具有全能分化能力的干細(xì)胞。此外，iPS細(xì)胞可由患者自身細(xì)胞誘導(dǎo)獲得，具有與患者自身相同的基因組成，不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。這種種特性表明iPS細(xì)胞成為理想種子細(xì)胞的可能性。
　　 以前很多研究顯示了釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix derivates，EM

4、D)在牙周再生中的作用。EMD能夠誘導(dǎo)無(wú)細(xì)胞外源性纖維牙骨質(zhì)的再生(acellular extrinsic fiber cementum，AEFC)。無(wú)細(xì)胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合較細(xì)胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合更加牢固。Boyan等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EMD可能具有骨促進(jìn)而不是骨誘導(dǎo)作用，但使用劑量應(yīng)達(dá)到或超過(guò)一定的閾值。在牙周組織再生的過(guò)程中，EMD可能作為一種基質(zhì)，形成與牙周組織發(fā)育時(shí)類似的微環(huán)境，通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)而有利于牙槽骨的再生

5、。
　　 本研究中，體外實(shí)驗(yàn)研究iPS細(xì)胞的成骨分化和EMD對(duì)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將iPS細(xì)胞和EMD共同用于牙周組織骨缺損的組織工程學(xué)修復(fù)，探討將其應(yīng)用于牙周再生的可行性。
　　 方法和材料：
　　 (1)使用基質(zhì)膠(Matrigel)包被培養(yǎng)皿，采用無(wú)滋養(yǎng)層的方法培養(yǎng)人的iPS細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)人iPS細(xì)胞中干細(xì)胞特異性基因Oct4和Nanog的表達(dá)。然后采用克隆懸浮的方法獲取擬胚體(em

6、bryoid body，EB)。
　　 (2)收集懸浮培養(yǎng)形成的EB，移入0.1％明膠處理過(guò)的培養(yǎng)板中，貼壁，并分別在普通培養(yǎng)液、加了礦化誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液和加了EMD的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察不同的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的向成骨方向分化和體外礦化的影響。采用PCR和Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子和蛋白，包括Runx2，OC，BSP等的mRNA表達(dá)；分別檢測(cè)不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞在培養(yǎng)后的第7，12，23，30天的堿性磷酸酶(alkalin

7、e phosphatase，ALP)的活性，觀察不同培養(yǎng)液中細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的ALP蛋白活性；將細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)28天后，茜素紅染色觀察其在體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力，并分析其礦化面積所占的百分比。
　　 (3)取12.5天左右的孕鼠，原代培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)，使用適量γ射線照射后用于制備滋養(yǎng)層。在MEF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)小鼠的iPS細(xì)胞，使用懸滴法獲得EB。

8、　　 (4)在裸小鼠的下頜磨牙區(qū)制作牙周骨缺損，然后使用組織工程技術(shù)修復(fù)牙周缺損。實(shí)驗(yàn)分為三組：?jiǎn)渭儾牧辖M，材料+EMD組和材料+EMD+鼠iPS細(xì)胞組，術(shù)中所用的材料為羥基磷灰石/絲復(fù)合支架材料。術(shù)后12和24天，Real-time PCR檢測(cè)三組標(biāo)本其新生骨組織的成骨相關(guān)因子和蛋白R(shí)unx2，OC，BSP，Osx的mRNA表達(dá)；對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Micro-ct檢測(cè)，立體觀察分析牙周缺損區(qū)硬組織的新生情況；組織學(xué)分析來(lái)觀察缺損處成骨，成牙

9、骨質(zhì)以及牙周修復(fù)的狀況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)在顯微鏡下觀察，未分化的人iPS細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，不典型的圓形或橢圓形，集落邊緣光滑清晰，有的集落邊緣可見有少量細(xì)胞分化。細(xì)胞呈團(tuán)狀排列，胞核大，胞漿少，核漿比較高?？寺∵吘壏只蟮募?xì)胞呈梭形或多邊型，細(xì)胞核小，胞漿豐富。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞中有Oct4和Nanog的表達(dá)。鏡下可觀察到，形成的EB懸浮在培養(yǎng)液中，呈現(xiàn)為規(guī)則或不太規(guī)則的球形。中心較致

10、密，邊緣透亮。
　　 (2)RT-PCR結(jié)果顯示，細(xì)胞BSP的mRNA表達(dá)水平，EMD和普通培養(yǎng)液中相差不大，均低于礦化誘導(dǎo)液組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異(P<0.01)。第20天時(shí)，Runx2的mRNA表達(dá)水平，EMD組高于礦化誘導(dǎo)液組和普通培養(yǎng)液組，礦化誘導(dǎo)液組又高于普通培養(yǎng)液組，且有極顯著性差異(P<0.01)。在培養(yǎng)的第30天，同樣的，EMD組仍然有最高水平的表達(dá)，且差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第20和30天時(shí)，O

11、C的mRNA表達(dá)水平，EMD組均為最低，且與其他兩組相比，均有極顯著性差異(P<0.01)；ColI的mRNA表達(dá)水平，在礦化誘導(dǎo)液組中最高，且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其余兩組差別不大。茜素紅染礦化結(jié)節(jié)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，三組中，EMD實(shí)驗(yàn)組生成的礦化結(jié)節(jié)也最少(P<0.01)。ALP活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在第23天左右，不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞其ALP活性達(dá)到最大值，且EMD培養(yǎng)液中的細(xì)胞ALP活性低于另外兩組。
　　 (3)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

12、在術(shù)后12天和24天，相較其它兩組而言，材料+EMD+鼠iPS細(xì)胞的動(dòng)物組均有較高的OC，Osx和Runx2的mRNA基因表達(dá)(P<0.01或者<0.05)。組織學(xué)分析顯示，術(shù)后12天和24天，新生成骨的百分比，在材料+EMD對(duì)照組中與在單純材料組中的相似。在絲材料+EMD+iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中比在其他兩個(gè)組中都要高，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。Micro-CT結(jié)果分析顯示在相同層次上，EMD+iPS細(xì)胞移植組的標(biāo)本比EMD組的

13、新形成的硬組織中多。使用3-D軟件將組織缺損處從CT立體圖像中切出來(lái)，也可以明顯看出實(shí)驗(yàn)組的硬組織密度要比對(duì)照組高的多，這些都提示了iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中更多硬組織的生成。HE染色也顯示，術(shù)后24天，移植了iPS細(xì)胞的動(dòng)物組有更多的新生骨組織和新生牙骨質(zhì)。
　　 結(jié)論：
　　 體外細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，EMD能很強(qiáng)的促進(jìn)RUNX2的mRNA表達(dá)，但是卻抑制了OC的表達(dá)和體外礦化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EMD可能促進(jìn)間充質(zhì)前體干細(xì)胞向成骨細(xì)胞