塔里木馬鹿鹿茸骨化及其相關(guān)因子關(guān)系研究.pdf

1、鹿茸是一種名貴的中藥材，具有溫腎壯陽、生精益血、強(qiáng)筋補(bǔ)髓的功效。它是鹿科動物特有的組織，具有很強(qiáng)的再生能力，在自然生長情況下每年都要經(jīng)歷發(fā)生、生長、骨化、脫落等過程。塔里木馬鹿是單位體重產(chǎn)茸量晟高的鹿科亞種，在生茸期鹿茸生長迅速，鹿茸角的生長的本質(zhì)就是在軟骨骨架上的成骨過程，期間大量的礦物質(zhì)元素尤其是鈣將沉積在鹿茸角中。鈣離子的沉積需要多種因素調(diào)控，關(guān)系比較密切的因素有鈣敏感受體(CaSR)、甲狀旁腺素(PTH)、雄激素(ADG)、降鈣

2、素(CT)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)、骨唾液酸糖蛋白(BSP)、骨鈣素(BGP)等激素。為了明確鈣離子在鹿茸中的沉積規(guī)律、以及鹿茸骨化與調(diào)控因素之間的關(guān)系，本試驗通過測定生茸期鹿茸鈣、血鈣、骨鈣、血液中ADG、PTH、CT、BALP、BGP及BSP等激素的含量和變化規(guī)律，對塔里木馬鹿鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞、前成軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨膜細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察細(xì)胞外鈣離子向胞內(nèi)流動以及測定胞內(nèi)鈣離子濃度，采用Real-t

3、ime PCR、WesternBlot等方法，分析CaSR、BSP、Runx2、GAPDH等基因表達(dá)情況，分析研究鹿茸角骨化機(jī)制。通過試驗研究，取得如下成果:
　　1、塔里木馬鹿鹿茸生長狀況，及鹿茸鈣、血鈣、骨鈣變化規(guī)律。
　　青年組塔里木馬鹿鹿茸角的生長速度在鹿茸角開始生長的第84天達(dá)到最大值，血Ca2+含量在鹿茸角開始生長的第70天出現(xiàn)下降趨勢，而后升高，于鹿茸角開始生長的第84天達(dá)到最高值。中年組、老年組馬鹿在鹿茸角開

4、始生長的第70天鹿茸角生長速度達(dá)到最大值，血液中Ca2+含量子鹿茸角開始生長的第57天達(dá)到最高值，在鹿茸角開始生長的第70天出現(xiàn)降低態(tài)勢，此后Ca2+含量又緩慢攀升。塔里木馬鹿鹿茸生長期約有100天（從春分至夏至），年齡大的鹿只其鹿茸角先開始生長、先進(jìn)入骨化階段。鹿茸鈣含量是不斷增加的，鹿茸骨化過程是分階段進(jìn)行的，在生長期表現(xiàn)為鈣在軟骨內(nèi)沉積，在骨化期則是軟骨組織迅速鈣化。馬鹿主要骨骼均存在脫鈣現(xiàn)象，鹿茸角中的鈣主要來源于肋骨，其次是骨

5、盆骨，而小腿骨與肩胛骨脫鈣程度最輕。
　　2、鹿茸骨化與血液中相關(guān)激素之間的關(guān)系。
　　在鹿茸角的不同生長階段，塔里木馬鹿外周血中血清ADG、PTH、CT、BALP、 BGP及BSP的含量存在著不斷的變化，尤其是骨化階段變化最為明顯。血清ADG水平的變化最明顯的是在鋸茸后，在此之前都一直處于低水平狀態(tài)，然后迅速升高，達(dá)到顯著性差異(P＜0.01)。血清PTH在鹿茸角生長階段變化一直不明顯，骨化期之前一直處于低水平狀態(tài)，但在進(jìn)

6、入骨化后期，各組馬鹿血清PTH含量顯著增高(P＜0.01)。各組馬鹿血清BALP含量在生茸初期至快速生長期均有下降趨勢，快速生長期至骨化后期，各組馬鹿血清BALP含量均增加，在鹿茸收獲以后，明顯下降。血清BGP、BSP均是隨著鹿茸角的生長而在升高，進(jìn)入骨化期后開始下降，鹿茸角收獲后就一直在下調(diào)，與鹿茸角的生長速度呈正相關(guān)。各組血清CT的濃度變化趨勢與鹿茸角生長率相同，但滯后于鹿茸角生長速度的變化，在生茸初期、茸快速生長期均緩慢升高，到骨

7、化后期達(dá)到最高，然后開始下降。說明血液中ADG、BALP、BGP、BSP等激素與鹿茸角快速骨化有著密切關(guān)系。血液中PTH、CT等激素與脫鈣的骨骼重建有著密切關(guān)系。
　　3、鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)及與鈣調(diào)節(jié)相關(guān)基因的關(guān)系。
　　采集處于生長期鹿茸頂端部分進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，實驗結(jié)果表明:前軟骨細(xì)胞(ACC)、間充質(zhì)細(xì)胞(MSC)易培養(yǎng)，而軟骨細(xì)胞(CC)生長較慢。用激光共聚焦方法檢測[Ca2+]i的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC的[Ca2+]i高于AC

8、C、CC，補(bǔ)充外源性鈣時，胞外Ca2+流入胞內(nèi)，MSC、ACC細(xì)胞需要的時間較短，而CC細(xì)胞則需要的時間較長。說明越臨近骨化期，鹿茸角中軟骨細(xì)胞的數(shù)量越多，需要的鈣量也越來越多。用實時熒光定量PCR擴(kuò)增CaSR、BSP、Runx2等基因，前軟骨細(xì)胞的BSP、CaSR、Runx2等基因mRNA表達(dá)水平明顯高于間充質(zhì)細(xì)胞，而軟骨細(xì)胞中只有Runx2基因的mRNA表達(dá)水平高于間充質(zhì)細(xì)胞、前軟骨細(xì)胞。Western Blot檢測得到了相同的結(jié)果