雌激素對(duì)骨髓造血功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、雌激素是一種十八碳固醇類激素，由脊椎動(dòng)物的卵巢、睪丸、胎盤或腎上腺皮質(zhì)所產(chǎn)生的。大多數(shù)哺乳動(dòng)物的雌激素主要是17β-雌二醇，其他重要的雌激素還有雌三醇和雌酮。雌激素是一類具有廣泛生物學(xué)活性的類固醇化合物，不僅可以促進(jìn)和維持女性生殖器官和第二性征，并且對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、肌體的代謝、骨骼的生長(zhǎng)和成熟均有明顯的影響。
　　骨髓造血功能是由造血干細(xì)胞及其所處的造血微環(huán)境之間的相互作用來(lái)共同實(shí)現(xiàn)的。造血干細(xì)胞是一種多潛能成

2、體干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的兩大特性，即自我更新和多向分化。一方面通過(guò)細(xì)胞不對(duì)稱分裂來(lái)完成自我更新的過(guò)程以維持造血干細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)恒定，另一方面則是在骨髓造血微環(huán)境各種基質(zhì)細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子的調(diào)控下分化為不同譜系的造血前體細(xì)胞，并進(jìn)一步分化為各系成熟的造血細(xì)胞，最終釋放入外周血以滿足機(jī)體正常造血需要。而發(fā)揮造血調(diào)控作用的骨髓造血微環(huán)境中的主要組成成分，則是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化發(fā)展而來(lái)的。間充質(zhì)干細(xì)胞也是一類多能干細(xì)胞，同樣具有自我分

3、裂增殖和多向分化的潛能。間充質(zhì)干細(xì)胞在不同的誘導(dǎo)條件下，可向成脂、成骨、成軟骨等多種細(xì)胞分化，并對(duì)骨髓造血功能起著支持、調(diào)節(jié)、輔助等作用。而成骨細(xì)胞又是造血干細(xì)胞所處的微環(huán)境，即造血干細(xì)胞壁龕中的重要組成部分，一方面其分泌的相關(guān)粘附因子可以將造血干細(xì)胞錨定在骨內(nèi)膜表面，另一方面成骨細(xì)胞通過(guò)自分泌或旁分泌各種類型的細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的數(shù)量和功能。
　　新近有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的表面均存在有雌激素受體，提示內(nèi)

4、分泌系統(tǒng)和造血系統(tǒng)之間可能存在著潛在的內(nèi)部聯(lián)系。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，我們提出了此次實(shí)驗(yàn)研究的基本思路，主要是從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面深入研究在雌激素濃度發(fā)生改變的情況下大鼠骨髓造血功能，包括造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)功能是否受到相應(yīng)影響并分析其可能的作用機(jī)制。通過(guò)這一研究，更進(jìn)一步將機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)和造血系統(tǒng)有機(jī)的聯(lián)系起來(lái)，并為將來(lái)臨床上治療由于激素改變而引起的各種類型的血液系統(tǒng)疾病尋找新的診治思路和治療手段，提供更充足的理論依據(jù)。
　　

5、第一章雌激素對(duì)去卵巢大鼠造血功能的影響及其機(jī)制的研究
　　目的：探討體內(nèi)雌激素改變對(duì)骨髓造血功能的影響及其可能的機(jī)制。
　　方法：利用去卵巢手術(shù)構(gòu)建雌激素缺乏的大鼠模型，通過(guò)骨髓病理切片中各組分(包括造血組織、脂肪組織及骨小梁、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞)的比例、髓外造血情況以及外周血改變來(lái)確定骨髓造血功能衰竭程度，并通過(guò)流式分析、克隆形成實(shí)驗(yàn)來(lái)明確雌激素改變是否對(duì)造血干細(xì)胞的數(shù)量和功能產(chǎn)生影響，以及通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中造血生

6、長(zhǎng)因子，如GM-CSF、IL-3、SCF、Epo和 TPO的表達(dá)量來(lái)說(shuō)明雌激素對(duì)造血微環(huán)境的影響。
　　結(jié)果：比較去卵巢組和假手術(shù)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去卵巢術(shù)后第12周時(shí)雌激素水平出現(xiàn)明顯下降，骨髓病理切片中造血組織/巨核細(xì)胞，骨小梁、成骨細(xì)胞所占比例明顯減少，而脂肪組織和破骨細(xì)胞所占比例相應(yīng)增高，并伴隨有自術(shù)后第16周起開(kāi)始出現(xiàn)的髓外遣血灶，且與相應(yīng)時(shí)間段假手術(shù)組之間均存在顯著性差異(p<0.05)。自術(shù)后第24周起，上述指標(biāo)在兩組間的

7、差異逐漸縮小(p>0.05)。而外周血中Hb和PLT的比例從去卵巢術(shù)后第24周起出現(xiàn)明顯下降，WBC在術(shù)后第28周時(shí)出現(xiàn)明顯下降(p<0.05)。骨髓HSC/HPC形成CFUs-GM的數(shù)目和HSC數(shù)量從去卵巢術(shù)后第16周始先后出現(xiàn)明顯下降，并伴隨肝脾髓外器官中HSC數(shù)量的明顯升高(p<0.05)。與假手術(shù)組相比，造血生長(zhǎng)因子GM-CSF、SCF、IL-3從去卵巢術(shù)后第12周至第24周先后出現(xiàn)明顯下降，而Epo和TPO則從第12周開(kāi)始即出

8、現(xiàn)明顯升高(p<0.05)。
　　結(jié)論：雙側(cè)卵巢切除術(shù)能成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。去卵巢大鼠雌激素缺乏后可出現(xiàn)骨髓造血功能的減低，肝脾髓外造血的代償，并最終導(dǎo)致外周血血細(xì)胞的減少。大鼠骨髓造血功能的減低與造血組織/巨核細(xì)胞、成骨細(xì)胞減少以及脂肪細(xì)胞增多有關(guān)；同時(shí)伴有造血干細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的降低。且造血生長(zhǎng)因子也參與了骨髓造血功能的調(diào)控。去卵巢大鼠是用來(lái)研究骨髓造血功能減退的理想模型，其大鼠最佳年齡段為3-9月齡。
　　第

9、二章雌激素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的影響
　　目的：探討體外雌激素對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化及造血干細(xì)胞功能的影響。
　　方法：通過(guò)全骨髓貼壁法及密度梯度離心法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)流式分析儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志及油紅O及茜素紅染色，RT-PCR，ELISA法來(lái)檢測(cè)成脂、成骨誘導(dǎo)分化等相關(guān)指標(biāo)。并在體外不同雌激素濃度(0，0.001nmol/L，0.01nmol/L，0.1nmol/L，1nmol/L

10、，)刺激下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化的影響以及通過(guò)RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞表面的相關(guān)雌激素受體α和β表達(dá)情況。通過(guò)免疫磁珠法分離及流式細(xì)胞分析儀鑒定骨髓來(lái)源的造血干細(xì)胞比例。在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)并通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)分析在不同雌激素濃度(0，0.01nmol/L，1nmol/L)刺激下造血干細(xì)胞形成CFUs-GM的能力。
　　結(jié)果：收集獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD29、CD44、

11、CD90高表達(dá)，而CD45和CD34低表達(dá)。倒置顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期呈圓形、三角形或不規(guī)則形，而到培養(yǎng)后期呈現(xiàn)紡錘體形或呈現(xiàn)向四周放射樣生長(zhǎng)狀態(tài)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)下形成大小不一的脂滴，可被油紅O染成橘紅色，RT-PCR檢測(cè)其LPLmRNA表達(dá)量明顯增高。而在成骨誘導(dǎo)下所形成的鈣結(jié)節(jié)則可被茜素紅染成紅色。在不同雌激素濃度作用下時(shí)，成脂分化的指標(biāo)，如油紅O染色程度隨雌激素濃度升高而降低，成骨分化的相關(guān)指標(biāo)，如

12、茜素紅染色程度及骨鈣素分泌量隨雌激素濃度升高而升高。成骨分化時(shí)雌激素受體α和β表達(dá)量與未誘導(dǎo)時(shí)相比無(wú)明顯差異(p>0.05)，成脂分化時(shí)雌激素受體α與未誘導(dǎo)時(shí)相比明顯下降，而雌激素受體β與未誘導(dǎo)時(shí)相比明顯升高(p<0.05)。免疫磁珠分離法可大大提高骨髓造血干細(xì)胞的回收率，倒置顯微鏡下觀察造血干細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞體積偏小，圓形或橢圓形，大小較均一，可見(jiàn)一個(gè)或多個(gè)大小不一的核仁。在不同濃度雌激素作用下，造血干細(xì)胞形成CFUs-GM的能力與雌激

13、素濃度呈正相關(guān)，即隨著雌激素濃度的升高，CFUs-GM的數(shù)目相應(yīng)增加。
　　結(jié)論：利用全骨髓貼壁法及密度梯度離心法可在體外成功分離，純化、培養(yǎng)及傳代SD大鼠的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。雌激素可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更傾向于向成骨誘導(dǎo)分化，而成脂誘導(dǎo)分化相應(yīng)減少。雌激素受體α和β在成骨誘導(dǎo)分化時(shí)其表達(dá)量與未誘導(dǎo)時(shí)相比無(wú)明顯差異，而在成脂誘導(dǎo)分化過(guò)程中，雌激素受體α明顯減少，而雌激素受體β明顯增加。通過(guò)免疫磁珠分選法可大大提高造血干細(xì)胞體