脊椎術(shù)中出血來源間充質(zhì)干細(xì)胞不同分離方法的效果比較.pdf

1、目的：通過三種分離方法分離脊椎術(shù)中出血標(biāo)本中的間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，比較得到的單核細(xì)胞（Mononuclearcell，MNC）數(shù)、細(xì)胞貼壁情況、原代培養(yǎng)時(shí)間、傳代至第三代后得到的細(xì)胞總數(shù)，探索針對(duì)脊椎術(shù)中出血來源間充質(zhì)干細(xì)胞理想的分離培養(yǎng)方法。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：以12例胸腰椎骨折病人為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。分別取術(shù)中脊椎松質(zhì)骨出血標(biāo)本30ml隨機(jī)分為3等份，標(biāo)記為A、B、C三組。A組采用密度梯度法，B組采用甲基纖維素（Met

2、hylcellulose，MC）沉降法，C組采用密度梯度結(jié)合甲基纖維素的兩步法分離MNC，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。72小時(shí)全量換液，以后3-5天按時(shí)換液，細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)后進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代。比較三種分離方法分離的MNC數(shù)、第三天貼壁細(xì)胞數(shù)、原代培養(yǎng)時(shí)間、第三代細(xì)胞數(shù)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定細(xì)胞。結(jié)果用3種分離方法提取MNC數(shù)分別為：A組（6.99±0.77）×106，B組

3、（11.5±1.70）×106，C組（8.20±0.96）×106，三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。培養(yǎng)第三天觀察細(xì)胞貼壁數(shù)分別為：A組11.40±2.37，B組為10.10±1.91，A組與B組兩者之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；C組24±3.27，與其它兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。比較三組原代培養(yǎng)時(shí)間，A組為28.20±1.69天，B組為28.40±2.12天，A組與B組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0

4、.05）；C組為20.40±1.17天，與其它兩組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。傳代培養(yǎng)3代后獲得的細(xì)胞數(shù)，A組為（6.39±0.30）×106，B組為（5.54±0.42）×106，A組與B組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；C組為（8.43±0.30）×106，與其它兩組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三組培養(yǎng)細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)一致，均為貼壁生長的長梭形或成纖維細(xì)胞樣。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，初