ART對(duì)人早孕期胎兒印記基因表達(dá)和修飾的影響及其對(duì)出生兒血脂代謝改變及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、隨著以體外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasm sperm injection，ICSI）為代表的現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques，ART)不斷推廣應(yīng)用，全世界ART出生兒已經(jīng)超過(guò)數(shù)百萬(wàn)。已有不少的流行病學(xué)研究顯示，除低出生體重兒發(fā)生增多、早產(chǎn)和新生兒出生缺

2、陷率升高之外，ART子代還增高了BW綜合癥(Beckwith-Wiedemann syndrome)和Angelman綜合癥(Angelman syndrome)等印記紊亂疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證明ART過(guò)程可對(duì)出生子代的H19、 Ascl2、Peg3、Xist等印記基因的表觀遺傳學(xué)修飾和表達(dá)產(chǎn)生影響。但受材料獲取的限制，人類的相關(guān)分子機(jī)理研究主要局限在分娩后的臍血和胎盤組織和ART兒童的外周血，另有少部分利用的是廢棄或多余的I

3、VF著床前胚胎。從具有向機(jī)體各類組織細(xì)胞分化潛能的全能性卵裂球或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，到著床后分化生長(zhǎng)的三胚層細(xì)胞，到各組織器官細(xì)胞的分化形成、直至新生兒的出生，人類細(xì)胞的基因組印記從修飾、調(diào)控、到表達(dá)發(fā)生了復(fù)雜的分子生物學(xué)變化，人類對(duì)ART宮內(nèi)早期生長(zhǎng)階段的胎兒組織有關(guān)基因表達(dá)和修飾影響研究的極度匱乏，是我們目前了解ART過(guò)程影響出生子代基因組表觀遺傳學(xué)健康發(fā)生發(fā)展過(guò)程的難點(diǎn)之一。
　　早在1995年英國(guó)學(xué)者Barker提出了著名的“胎

4、兒源性疾病學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為胎兒期宮內(nèi)發(fā)育不良或生長(zhǎng)過(guò)度導(dǎo)致的出生兒體重改變，與成年后肥胖、糖尿病、高血壓等疾病聯(lián)系緊密。其中胎兒宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)改變，導(dǎo)致成年后脂肪代謝異常、胰島素抵抗、動(dòng)脈血壓增高和腎臟結(jié)構(gòu)改變已被多個(gè)研究證實(shí)。2010年，Motrenko等進(jìn)一步提出“疾病胚胎起源學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為胚胎形成時(shí)期外界不良因素可增加成年后慢性疾病的發(fā)生率，其中不良環(huán)境暴露引起的配子、胚胎和胎兒組織表觀遺傳學(xué)修飾改變，被認(rèn)為是重要的發(fā)病機(jī)理之一。ART對(duì)配子

5、成熟、精卵結(jié)合和胚胎生長(zhǎng)過(guò)程的干擾，ART兒出生體重和表觀遺傳學(xué)修飾改變的證據(jù)，均與“胚胎-胎兒源性疾病”的發(fā)病機(jī)理相類似，提示ART子代存在因胚胎/胎兒因素，導(dǎo)致成年后諸如心血管疾病一類疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上升的可能。現(xiàn)已有證據(jù)表明，人類ART出生兒存在血壓增加、空腹血糖和血脂水平升高的趨勢(shì)。我們研究小組先行開展ART小鼠模型研究顯示，老年（1.5周歲）ART小鼠存在血壓、心率、血脂、糖耐量和胰島素水平的顯著性改變，其發(fā)生和發(fā)展與脂代謝重要調(diào)

6、節(jié)通路——胰島素誘導(dǎo)基因(insulin-induced gene，INSIG)，SREBP裂解激活蛋白(sterol regulatoryelement-binding protein cleavage-activating protein，SCAP)和類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)基因的表達(dá)和修飾改變存在聯(lián)系。但迄今為止，人類ART子代有關(guān)血脂

7、代謝改變的發(fā)生機(jī)理研究仍鮮有報(bào)道，有關(guān)人ART胎兒、胎盤組織INSIG-SCAP-SREBP通路基因表達(dá)和修飾改變的研究仍為空白。
　　2007年Kobayashi等發(fā)現(xiàn)少精子癥患者精子存在印記位點(diǎn)甲基化的異常，男性不育患者的精子會(huì)含有表觀遺傳異常的印記基因，并具有將此缺陷遺傳給子孫的風(fēng)險(xiǎn)，且精子質(zhì)量越差，甲基化印記改變?cè)矫黠@。后來(lái)有學(xué)者對(duì)絨毛DNA和相對(duì)應(yīng)的精子DNA同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)了精子細(xì)胞攜帶的異常印記可以傳遞到子代絨毛，

8、Kobayashi等的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，41％的子代DNA甲基化異?？梢栽诟赣H精子中找到相同的異常改變，這也進(jìn)一步提示印記基因的異常改變有可能源自于父親精子本身的印記異常。ICSI技術(shù)是當(dāng)前男性不育治療最為有效的方法，但其在克服精子數(shù)量、活力、形態(tài)異常引起的受精障礙的同時(shí)，也跨越了的機(jī)體的自然選擇機(jī)制，使存在遺傳或表觀遺傳學(xué)異常的精子與卵子受精發(fā)育，使出生子代攜有同樣遺傳或表觀遺傳學(xué)異常后代的風(fēng)險(xiǎn)升高。故此，研究用于ICSI的少弱精子癥患

9、者的精子DNA的表觀遺傳學(xué)修飾改變，有助于人類ICSI后代表觀遺傳學(xué)改變的病因?qū)W分析。
　　旨在為揭示ART子代印記基因表達(dá)修飾改變提供胎兒組織依據(jù)，考察ART出生兒血脂代謝改變發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，我們分別收集IVF、ICSI和單純藥物卵巢刺激（control ovarian stimulation，COS）的三胎妊娠胚胎減滅術(shù)后的早孕期胎兒組織，以及IVF、ICSI和自然妊娠足月分娩的臍血、胎盤組織，分別進(jìn)行了ART早孕期

10、胎兒印記基因表達(dá)及其差異甲基化區(qū)域修飾變化、ART對(duì)出生兒血脂代謝的影響及其機(jī)制的研究。并且在發(fā)現(xiàn)ICSI胎兒、胎盤存在血脂代謝調(diào)節(jié)基因甲基化修飾顯著性改變的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了ICSI少弱精子癥精子基因DNA甲基化的改變研究。本文從以下及部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分ART早孕期胎兒印記基因表達(dá)及其差異甲基化區(qū)域修飾變化研究。
　　目的:
　　考查生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)印記基因IGF2, H19和神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)印記基因SNRPN,

11、UBE3A在ART早孕期胎兒組織中表達(dá)和甲基化狀態(tài)的改變，為揭示ART子代印記基因表達(dá)修飾改變提供胎兒組織依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1分別收集IVF、ICSI和單純藥物卵巢刺激(control ovarian stimulation，COS)的三胎妊娠胚胎減滅術(shù)病例，獲取早孕期胎兒組織。
　　2分別提取上述三組患者早孕期胎兒組織的RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR(quantitativereal time RT-PCR

12、)檢測(cè)各標(biāo)本印記基因IGF2，H19, SNRPN和UBE3A的mRNA表達(dá)水平，比較其在IVF、ICSI和COS三組間的表達(dá)差異。
　　3分別提取上述三組患者早孕期胎兒組織的DNA，焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)檢測(cè)各標(biāo)本印記基因IGF2, H19, SNRPN和UBE3A印記基因差異甲基化區(qū)域(differentiation methylation regions，DMRs)的甲基化修飾狀態(tài)，比較三組間的甲基化修飾

13、差異。
　　結(jié)果:
　　1印記基因的表達(dá)水平分析:
　　(1) IVF組的H19表達(dá)水平顯著性高于COS組(P＜0.05);但I(xiàn)VF組與ICSI組，ICSI組與COS組間比較，H19表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05);
　　(2) IGF2, SNRPN和UBE3A表達(dá)水平在IVF組、ICSI組和COS組間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　2印記基因差異甲基化區(qū)域的甲基化水平
　　(1) IVF

14、組和ICSI組的IGF2 DMR甲基化水平均顯著性高于COS組(P＜0.05);IVF組和ICSI組間差異無(wú)顯著性(P＞0.05);
　　(2) IVF組和ICSI組的H19 DMR甲基化水平均顯著性低于COS組(P＜0.05)，IVF和ICSI組間差異無(wú)顯著性(P＞0.05);
　　(3) IVF組與ICSI組的SNRPN DMR甲基化水平顯著性高于COS組(P＜0.05)，IVF和ICSI組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)

15、;
　　(4) IVF組、ICSI組和COS組的UBE3A DMR的各CpG位點(diǎn)甲基化水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)人類ART的精卵體外處理、輔助受精、或受精后胚胎的體外培養(yǎng)可影響早孕期胎兒組織印記基因IGF2, H19和SNRPN DMR的甲基化修飾，但ART過(guò)程中最具損傷性的ICSI過(guò)程的此類影響不明顯。
　　(2)雖然ART可顯著改變?cè)缭刑航M織多個(gè)印記基因DMR的甲基化修飾，但

16、同時(shí)能夠顯著改變基因轉(zhuǎn)錄水平的只有H19，提示早孕胎兒組織印記基因存在糾正/減低ART引發(fā)的甲基化修飾改變表觀遺傳學(xué)效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　(3) IVF早孕期胎兒組織中H19呈低甲基化和高表達(dá)水平，推測(cè)可能和ART所致的低出生體重風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。
　　第二部分ART對(duì)出生兒血脂代謝的影響及其機(jī)制研究。
　　目的:
　　考查ART出生兒血脂生化指標(biāo)的改變;檢測(cè)ART早孕期胎兒組織和足月胎盤組織脂代謝重要調(diào)節(jié)通路INS

17、IG-SCAP-SREBP的基因表達(dá)，及其調(diào)節(jié)區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化修飾狀態(tài)，闡明ART出生兒血脂生化指標(biāo)改變發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　材料和方法:
　　1收集IVF、ICSI和COS三胎妊娠胚胎減滅術(shù)后的早孕期胎兒組織，以及IVF、ICSI和自然妊娠(natural conception，NC)足月單胎剖宮產(chǎn)分娩的臍血、胎盤組織及相應(yīng)的母血。
　　2測(cè)定臍血和母親血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的

18、水平，比較他們?cè)贗VF、ICSI和自然妊娠三組間的差異。
　　3分別提取上述各組早孕期胎兒組織和足月胎盤組織的RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)各標(biāo)本NSIG1，INSIG2，SCAP，SREBF1，SREBF2的mRNA表達(dá)水平，比較其在三組間的表達(dá)差異。
　　4選擇mRNA表達(dá)有顯著性差異的上述目的基因，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)上述三組早孕期胎兒組織和足月胎盤組織中各基因調(diào)節(jié)區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化修飾狀態(tài)，比較其在三組間的甲基化

19、修飾差異。
　　結(jié)果:
　　1 ICSI新生兒臍血中甘油三酯水平顯著高于IVF組和NC組(P＜0.05)。
　　2 ICSI組胎兒組織INSIG1 mRNA的水平顯著性高于IVF組和COS組(P＜0.05);和IVF組和自然妊娠組比較，ICSI胎盤組織INSIG1 mRNA的水平高度顯著性升高(P＜0.01)。
　　3與自然妊娠組比較，ICSI胎盤組織SREBF1mRNA的水平顯著性增高(P＜0.05)。

20、　　4無(wú)論是胎兒還是胎盤組織，INSIG2,SCAP和SREBF2 mRNA的水平在各組間的表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　5在胎兒組織中，ICSI組INSIG1的5個(gè)CpG位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)甲基化水平顯著性低于IVF組和COS組(P＜0.01);IVF組和COS組比較，其甲基化水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　6在胎盤組織中，IVF和ICSI組INSIG1的5個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平均顯著性低于自然妊娠組，其中

21、ICSI組INSIG1呈去甲基化狀態(tài)(P＜0.01);此外在SREBF1的7個(gè)CpG位點(diǎn)中，在IVF組有2個(gè)，ICSI組有3個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平顯著性低于自然妊娠組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1 ICSI可顯著影響胎兒組織INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的mRNA表達(dá)水平，其發(fā)生機(jī)理與相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化修飾水平改變有關(guān)。
　　2 ICSI引起的INSIG-SCAP-SREBP通路部分基

22、因的表達(dá)和甲基化修飾改變可在妊娠足月胎盤組織得以進(jìn)一步的增強(qiáng)，并可能與ICSI新生兒臍血甘油三酯水平的顯著性升高相關(guān)。
　　3 IVF亦可導(dǎo)致胎盤組織INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的甲基化修飾改變，但改變程度相對(duì)要輕，對(duì)相應(yīng)基因表達(dá)及其出生兒血脂代謝的影響不明顯。
　　第三部分少弱精子癥精子中印記及非印記基因DNA甲基化的改變。
　　目的:
　　選取之前發(fā)現(xiàn)在ART胎兒和胎盤組織中存在甲基化修飾改變

23、的印記基因IGF2，H19，SNRPN以及非印記基因INSIG1，SREBF1，考察他們?cè)诓煌腁RT精子中的DNA甲基化狀態(tài)。
　　材料和方法:
　　1收集ART過(guò)程中受精完成后剩余的精子，根據(jù)術(shù)前精子參數(shù)分為正常精子組（用于IVF受精）和少弱精子癥組（用于ICSI受精）。
　　2用焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)精子IGF2，H19，NRPN，INSIG1，SREBF1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化修飾狀態(tài)，比較其在不同ART精子中的甲基化水

24、平是否存在差異。
　　結(jié)果:
　　1少弱精子癥精子IGF2, SNRPN和INSIG1各CpG位點(diǎn)的甲基化水平和正常精子相似，差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　2少弱精子癥精子H19的6個(gè)CpG位點(diǎn)中有5個(gè)位點(diǎn)甲基化水平顯著低于正常精子（其中CpG3，CpG4:P＜0.01;CpG2，CpG5，CpG6:P＜0.05）。
　　3和正常精子相比，少弱精子癥精子在SREBF1的7個(gè)CpG位點(diǎn)中有2個(gè)位點(diǎn)（CpG3:

25、P＜0.01和CpG4:P＜0.05）甲基化水平顯著高于正常精子。
　　結(jié)論:
　　1少弱精子癥精子中存在印記基因H19和非印記基因SREBF1的甲基化狀態(tài)改變。
　　2印記基因IGF2,SNRPN和非印記基因INSIG1在少弱精子癥精子中未見異常甲基化改變。
　　3 ART尤其是ICSI胎兒和胎盤中印記基因和非印記基因的甲基化修飾改變并非和相應(yīng)精子中的改變趨勢(shì)一致，說(shuō)明ICSI所引起的子代表觀遺傳改變并非完全來(lái)