mMIP-1α-DT390重組免疫毒素治療小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的研究.pdf

1、自身免疫性疾病(autoinunune disease，AID)是由于各種原因?qū)е聶C(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生自身抗體或自身致敏淋巴細(xì)胞，造成正常組織損傷而引起的一大類疾病，是公認(rèn)的人類難治性重大疾病之一。目前臨床上缺乏針對(duì)AID特效的治療方案，常采用各種免疫抑制劑治療AID，但這些制劑副作用大，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的全面抑制。 人類多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的

2、炎癥性、多發(fā)性．AID，這種疾病具有癥狀復(fù)雜多變、緩解與復(fù)發(fā)交替進(jìn)行、病程遷延不規(guī)律等特點(diǎn)，多年來(lái)一直困擾著患者。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一種由活化T細(xì)胞(主要是Th1細(xì)胞)介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，主要病理特征為血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)脫髓鞘反應(yīng)，在臨床癥狀、生化指標(biāo)及病理等方面與MS具有相似的特征，因此EAE被認(rèn)為是研究的MS良好

3、動(dòng)物模型，也是Thl細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性AID的典型代表。 免疫毒素(immunotoxins，ITs)是一類將生物毒素與導(dǎo)向載體(抗體或細(xì)胞因子)連接起來(lái)構(gòu)成的雜合分子。導(dǎo)向載體與某些細(xì)胞表達(dá)或過(guò)量表達(dá)的特異性抗原、糖類結(jié)構(gòu)或細(xì)胞因子受體特異結(jié)合，攜帶的毒素分子到達(dá)特定的靶細(xì)胞，通過(guò)抑制蛋白合成或改變信號(hào)傳遞途徑殺死靶細(xì)胞，同時(shí)不影響其它正常細(xì)胞的功能。因此，如果能構(gòu)建一種可以靶向性殺傷抗原特異性活化T細(xì)胞的重組免疫毒素，就可

4、能會(huì)達(dá)到預(yù)防和治療EAE的目的。 本課題以活化T細(xì)胞(特別是Th1細(xì)胞)膜表面高表達(dá)的CCR5受體的配體巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-lα(maerophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)基因片段作為導(dǎo)向分子，與白喉毒素活性片段DT390(diphtheriatoxin 390，DT390)基因重組成一種新型重組免疫毒素，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體包被后，用于治療C57BL／6品系小鼠的EAE模

5、型。通過(guò)觀測(cè)小鼠臨床癥狀、神經(jīng)系統(tǒng)病理改變、外周血相關(guān)細(xì)胞因子水平動(dòng)態(tài)變化、T、B細(xì)胞及Thl、Th2細(xì)胞數(shù)量及比例的變化，評(píng)估該重組免疫毒素預(yù)防和治療EAE的效果。 方法 (1)通過(guò)RT-PCR方法，從小鼠肝臟中獲得mMIP-1α基因片段；通過(guò)PCR方法擴(kuò)增含有DT390基因的質(zhì)粒獲得DT390基因片段；將 mMIP-1α及DT390基因片段定向插入原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32α(+

6、)-mMIP-1α-DT390：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，篩選出含有正確插入片段的陽(yáng)性克?。粚?duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列分析；鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，Western-blot方法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。 (2)PCR擴(kuò)增mMIP-1α-DT390基因片段，然后定向插入到真核質(zhì)粒SRa中，構(gòu)建重組質(zhì)粒SRa-mMIP-1a-DT390；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，篩選出含有正確插入片段

7、的陽(yáng)性克?。簩?duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析和DNA序列分析；鑒定正確的質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，免疫熒光法檢測(cè)重組毒素的表達(dá)情況；MTT法測(cè)定mMIP-1α-DT390的生物學(xué)活性。 (3)使用改進(jìn)的Kies法從新鮮牛脊髓中提取MBP粗提物，經(jīng)SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白的濃度和純度：將MBP粗提物與福氏完全佐劑(FCA)等量混和，制成油包水的乳劑，同時(shí)加入百日咳桿菌菌液，采用腹腔注

8、射的方式誘導(dǎo)C57BL／6 小鼠的EAE模型。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癥狀、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理改變及相關(guān)細(xì)胞因子水平的檢測(cè)，評(píng)估EAE模型的構(gòu)建情況。 (4)將上一步獲得的真核表達(dá)質(zhì)粒SRα-mMIP-1α-DT390經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體包被后，以肌注的方式治療小鼠EAE模型。觀測(cè)小鼠的臨床癥狀、腦部病理改變、外周血T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、T／B細(xì)胞及Thl/Th2細(xì)胞水平的變化，了解該重組免疫毒素的治療效果。 結(jié)果 (1)通過(guò)R

9、T-PCR法從小鼠肝總RNA中獲得了210 bp大小的mMIP-1α基因片段：通過(guò)PCR方法獲得了DT390基因片段；通過(guò)連接構(gòu)建重組免疫毒素的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32α(+)-mMIP-1α-DT390。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切分析及DNA測(cè)序證實(shí)：mMIP-lα及DT390基因片段正確插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)中，并且目的基因的閱讀框架保持不變；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，Western-blot結(jié)果顯示

10、其細(xì)菌裂解物可與抗mMIP-lα及抗DT390的多抗結(jié)合，在雜交膜上顯示出與預(yù)期分子量大小一致的約67 KD的條帶。 (2)真核表達(dá)質(zhì)粒SRα-mMIP-lα-DT390經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切分析及DNA測(cè)序證實(shí)，mMIP-lα-DT390基因片段正確插入到真核表達(dá)質(zhì)粒SRα中；通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)證實(shí)：轉(zhuǎn)染真核質(zhì)粒在NIH3T3細(xì)胞中可瞬時(shí)表達(dá)目的蛋白：MTT法證實(shí)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清對(duì)ConA刺激的小鼠活化T細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，且

11、該抑制效應(yīng)具有劑量依賴關(guān)系。 (3)提取出的MBP蛋白粗提物濃度為1.337 mg／ml，SDS-PAGE的結(jié)果顯示蛋白片段相對(duì)分子量約為17 KD，與預(yù)期值相符。實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)了EAE的典型癥狀，腦部病理切片顯示：大腦皮質(zhì)疏松，小腦腦膜下及腦膜血管周圍大量CCR.5<'+>淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等改變，EAE模型小鼠外周血中IFN-γ水平明顯升高，最高值達(dá)到337pg/ml。 (4)經(jīng)重組免疫毒素mMIP-lα-DT390治療的

12、小鼠臨床癥狀減輕，臨床癥狀評(píng)分降低；冰凍切片免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CCR5<'+>細(xì)胞的數(shù)量明顯減少；外周血EIJSA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Thl細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)降低，Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-4表達(dá)無(wú)明顯改變；流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：脾臟細(xì)胞T細(xì)胞及Thl細(xì)胞數(shù)量均降低；脾臟B細(xì)胞及Th2細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯改變；T／B細(xì)胞比例及Thl／Th2細(xì)胞比例均降低。 結(jié)論 (1)成功構(gòu)建了一種新型重組免疫毒素mMIP-1 α-DT

13、390原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了目的蛋白的表達(dá)。 (2)成功構(gòu)建了一種新型重組免疫毒素mMIP-1 α-DT390真核表達(dá)質(zhì)粒，并在真核細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，其轉(zhuǎn)染上清對(duì)活化T細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。 (3)利用自提的MBP成功誘導(dǎo)C57BL／6小鼠的EAE模型。 (4)重組免疫毒素mMIP-1 α-DT390對(duì)小鼠EAE模型有較為明顯的防治效果。顯示重組免疫毒素的基因治療方法對(duì)防治自身免疫